实验1 DNA提取纯化检测-jgh.ppt

实验一真核细胞染色体DNA的分离、纯化和检测实验目的
红细胞裂解液裂解红细胞

细胞裂解液裂解白细胞

用蛋白酶K水解蛋白质

有机溶剂酚、氯仿抽提

在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA

再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分

即可获得染色体DNA
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。纯净的DNAA260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8
纯净的RNAA260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0
如果制备的DNA样品A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；
A260/A280>2，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；
如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。
提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。实验材料酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
70%乙醇
TEbuffer
RNAse
琼脂糖
TAE电泳缓冲液
电泳设备
紫外分光光度计
凝胶成像系统染色体DNA的制备方法10.加入酚：氯仿500μl，混匀后10000rpm，离心5分钟，取上清，至1.5ml离心管，加入氯仿500μl，混匀后10000rpm，离心5分钟，取上清至5ml离心管。（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)
11.加入1ml无水乙醇,轻轻混匀可见DNA凝集。
12.12000rpm，离心2分钟，弃上清。
13.用1ml70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心2分钟，弃上清。
14.开盖室温干燥沉淀5分钟。
15.加入30μlDDW（无菌水）溶解DNA,取10μl电泳。
16.加入3mlDDW至剩余样品中，测OD260和0D280，计算DNA浓度及OD260/0D280。

琼脂糖凝胶电泳方法5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。

6．待测的DNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6×loadingBuffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。

7．打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)。

8．电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条条带分开后，可以结束电泳。一般20分钟~2小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。DNA样品的纯化和定量检测方法DNA制备注意事项电泳注意事项2.DNA分子的迁移率：

影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施：
(1)每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照。电泳。
(2)选择最合适的电泳条件。
(3)提高分子筛效应，降低电荷效应。
3.EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法：

(1)在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。
(2)只在胶中加入EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染的可能。
(3)在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。

4．溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300~400bp双链线状DNA。

5．点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。

6．EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有EB的面朝里，有EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。DNA定量检测注意