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实时荧光定量PCR——TaqMan探针法序列选取应在基因的保守区段; 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构; 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%; 引物之间的TM相差避免超过2℃; 引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基; 为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子; Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp; 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。TaqMan探针设计原则TaqmanMGB探针设计