实验二 PCR扩增及其产物的纯化.ppt

实验二PCR扩增实验三PCR产物的纯化实验目的和要求实验原理每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。PCR反应系统的组成引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。实验步骤94℃变性5min后，开始以下循环：94℃变性反应40s55℃退火反应30s72℃延伸反应1min最后72℃反应2minPCR产物电泳检测A.从PCR产物中直接回收纯化DNA(Promega公司)
直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μlPCR反应物；
进入C步骤。B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA
用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带；
用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；
将300μl(300mg)琼脂糖条带转移至1.5ml离心管。直接在65℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；
加等体积的溶液BE；
下接C步骤。C.纯化步骤
将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混合均匀。
将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。
12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上
加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段
加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。
12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解
将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15μl溶Ｅluent(60℃预热)，静置２min．12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段。贮存于-20℃备用。学生PCR实验结果(4l)作业