干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测.pdf

三个方向诱导分化

诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化

一、诱导方法

将细胞悬液置于50mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导

MSCs向软骨细胞转化的诱导因子:一致统一的诱导物质()

转化生长因子β110ng/ml,

（左旋）维生素C50mg/L(也有0.1mmol/L)

地塞米松0.1nmol/L（也有10nmol/L）
ITS50mg/ml

丙酮酸钠1mmol/L

亚油酸5.35ug/mg

牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。去除培养液,晾干,

①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)免疫组化，按试剂盒说明

书操作；

②用alcianblue孵育5min,流水冲洗2min,

麦氏苏木素复染5min,流水冲洗2min,晾干，

显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：

MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：

培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，

10％甲醛固定lh，

自来水冲洗15min，

双蒸水冲洗1次，

滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，

加人95％乙醇，洗去多余的染液，

烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化

成骨诱导培养:取第3代细胞,接种入含体积分数为

0.1的新生牛血清、

0.1μmol/L地塞米松、

50μmol/L抗坏血酸、

10mmol/Lβ-甘油磷酸钠

的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养,进行形态观察、功能检测。间充质干细胞

成骨特性检测:

①碱性磷酸酶组织化学染色:

取成骨诱导14d的细胞,40g/L中性甲醛固定15min,Gomori改良

钙钴法染色。取5块玻片,每片随机取2个视野,采用网格计数法,计算碱性磷酸酶染色

阳性细胞的百分比。

②碱性磷酸酶活性检测:

取第3代细胞,以1×105/孔的密度接种于6孔板中,分别成骨诱导3,5,7,10,12,

14d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

③钙结节染色:

VonKossa’s矿化结节染色法

原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外

线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

Vankossa银染色法

试剂：
1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100ml。

2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100ml。

培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次

2.2%硝酸银内置暗处1小时

3.蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟

4.还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）

5.5%硫代硫酸钠1小时

1.固定后的细胞爬片用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗涤2遍；

2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45min，蒸馏水洗涤；

3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；

4.1%中性红衬染1min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％

1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。

1.Sectionstowater.切片脱蜡至水

2.Placesectionsin1%silvernitratesolutionunderultra-violetlightfor45minutes.

置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟

3.Washindistilledwater.蒸馏水漂洗

4.Treatwith3%sodiumthiosulphatefor5minutes.3％硫代硫酸钠处理5分钟

5.Washinwater.用水漂洗

6.CounterstainwithvanGiesonfor5minutes.VanGieson复染5分钟

7.Washinalcohol.乙醇漂洗
8.Clear.MountsectionsinDPX透明封片

结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.

A组以现行报道方法染色:4%多聚甲醛固定标本,

1%硝酸银溶液紫外线下染色10min,

用5%硫代硫酸钠染色2min,

1%中性红复染10min,

酒精冲洗后观察。

B组以改进的方法染色:

4%多聚甲醛固定标本,

5%硫代硫酸钠孵育30min,蒸馏水冲洗

,然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色30min,

蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质,