DNA和CDNA文库构建.ppt

第八章DNA文库的构建掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、cDNA文库构建的基本原理和操作技术；熟悉：cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成；基因文库（genelibrary)：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。构建基因文库的基本程序：（1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA，（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA，（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌，（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因文库基因文库的应用：二、基因组DNA文库的构建（二）文库的代表性和随机性一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon公式：（三）、基因组DNA文库的构建流程①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。1．基因组DNA文库的载体制备载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。寻找最适的载体与基因组之间的比例。首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。4．文库的质量检测指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。例如：将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kb的Spel片段上则可将Spel酶切的基因组DNA中的8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。三、cDNA文库的构建2、均一化cDNA文库通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。3、cDNA文库的构建插1）mRNA的完整性及mRNA的富集通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的完整性，间接判断mRNA的完整性。如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带，表明样品己严重降解。mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。2）第一链cDNA合成由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶，需要引物反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生完整的cDNA)3)第二链cDNA的合成常用方法1）它是以cDNA的第一条链为模板，设计并合成一组引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA,由于其放大的高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限的生物材料构建cDNA文库，特别适合低拷贝mRNA的克隆。2）同时，可用总mRNA作为合成cDNA第一链的模板，不用纯化mRNA，所以避免了纯化过程中某些信息分子的丢失。3）PCR合成cDNA第二链是通过在第一链3’端同聚物加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核苷酸，所以容易得到完整的cDNA。4、双链cDNA的分级分离连接前回收大于500bp的cDNA用于连接。去掉引物、街头及反转录产生的各种不完整的cDNA链，提高文库质量。5、双链cDNA与载体连接1）同聚物加尾：2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的接头是最常用的方法3）cDNA的定向插入：cDNA两端添加不同的限制性酶切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接末端转移酶+dCTPCH36、cDNA文库的载体选择均一化cDNA文库是克服由于基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。构建均一化cDNA文库主要有两种途径：基因组DNA饱和杂交法步骤：1）基因组DNA的酶切、固定2）基因组DNA变性成单链3）分离纯化cDNA文库的混合质粒4）文库DNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定相应的cDNA,5)洗脱cDNA并重新转化受体菌。限制：由于基