结核杆菌研究进展(综述).doc

结核杆菌DNA疫苗研究进展结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）统计，全世界约有20亿人感染过结核分枝杆菌，每年约有200～300万人死于结核病，其人数是其他传染病死亡人数的总和。20世纪末，结核病仍然是全球感染和传染病的第一“杀手”。当前唯一可用的疫苗-卡介苗（BacilleCalmetteGuerin，BCG）的免疫效果下降，对其保护效果也存在争议，经试验证明其总有效率仅为50%。而且对成年人的免疫效果也不明确，因此现在急需研制出新型疫苗。目前新型结核疫苗研制方向主要有：减毒结核疫苗，高表达重组疫苗，蛋白质亚单位疫苗和DNA疫苗（又称核酸疫苗或基因疫苗）等四种。本文就结核DNA疫苗的新进展作一简要综述。1DNA疫苗的作用机理DNA疫苗的作用机理是能让外源基因在真核细胞内表达，表达出来的蛋白质和MHC-Ⅰ类分子结合后被呈递到细胞的表面，再被CD8+T淋巴细胞的受体识别而诱发CTL的细胞毒反应，这对细胞内寄生的结核杆菌有很强的杀伤作用。但目前对DNA疫苗激活免疫系统的详细机理还不是很清楚，不过有以下几种机制可对此进行解释：①DNA疫苗直接致敏体细胞；②基因疫苗转染APC（抗原递呈细胞-巨噬细胞或树突状细胞）；核酸疫苗在APC内表达的蛋白质抗原作为“内源性抗原”，结合MHC-Ⅰ类分子后被T细胞受体识别，这是诱导细胞毒T细胞的最有效的途径；③交叉致敏；④细菌质粒具有免疫佐剂功能[1]。当人或小鼠感染结核菌后，巨噬细胞（MΦ）吞噬结核菌但却不能将其杀灭。因此结核菌在MΦ中生存繁殖，外来药物与抗体也无法直接消除结核菌。只有人MΦ被抗原特异的细胞毒性T细胞溶解后，其中寄生的毒性结核菌才能被杀死。因此可以设想，杀菌性T细胞的功能低下导致了小鼠感染结核菌后免疫抵抗力的下降，造成慢性感染，在人体也可发生类似情况。在主动免疫的机制中，可溶性蛋白抗原主要刺激CD4+T细胞反应，而DNA疫苗则可引起强烈的CD8+T细胞反应，诱导产生大量的抗原特异性CD8+/CD4-/CD44highT细胞，分泌IFN-γ[2]，引起有效的细胞免疫。2编码抗原基因重组的DNA疫苗1996年8月出版的《自然医学杂志》同时刊登了Huygen和Tascon两位博士各自分别完成的结核病DNA疫苗的论文，1998年英国剑桥Sanger中心完成结核杆菌基因组序列的测定，为结核DNA疫苗的研制提供了保证，使其研制进入飞跃发展阶段。实验证明结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性抗原，因此主要的结核DNA疫苗都是将编码这些抗原的基因克隆到载体中构建而成的。目前结核DNA疫苗的研制主要有：以Antigen85和hsp65，以及结核杆菌培养过滤液中的分泌蛋白ESAT-6和MPT-64编码基因重组的DNA疫苗[3]。2.1以Antigen85编码基因构建的DNA疫苗在结核菌和BCG的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体（Antigen85complex），由Ag85A，Ag85B，Ag85C组成的30～32kD蛋白家族，分别由三种不同但高度同源的基因编码。在感染结核或麻风菌与卡介苗免疫的小鼠及人体上，Ag85复合体不仅可以刺激产生体液免疫，尚可激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8+T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升。结核病的免疫学特征表现为细胞免疫功能低下，研究结果显示CD8+T细胞的保护功能可能与IFN-γ诱导有关，这些实验揭示可利用Ag85复合体基因构建DNA疫苗。其中Ag85A和Ag85B被认为更有效，一些实验已证实，由Ag85A和Ag85B编码的DNA疫苗对小鼠抵抗由呼吸道或静脉感染的结核菌有保护作用[4]，目前一些研究小组正在致力于此方面的研究。2.1.1Ag85A用含结核菌38kD蛋白基因与Ag85A及HSP65编码基因构建的DNA疫苗免疫的动物模型中，可产生很好的免疫保护作用。以人工合成的包括Ag85A全部20肽刺激小鼠脾细胞分泌IL-2，IFN-γ为指标，发现DNA免疫诱导产生的T细胞反应在强度和广度上均比皮下注射结核菌感染的效果好，CTL活性也上升。编码Ag85A的DNA疫苗与BCG有同样的诱导保护作用。Huygen把结核杆菌的抗原85A基因克隆到美国Merk公司的VIJ载体中构建了DNA疫苗，然后将DNA在体外转染肌肉瘤细胞，证明了DNA疫苗能够在真核细胞中表达结核杆菌的抗原85A蛋白质。给Balb/c和C57BL/6小鼠肌肉注射Ag85A疫苗，能在小鼠体内诱发很强的体液和细胞免疫反应。2.1.2Ag85B由MTB（Mycobacteriumtuberculosis）H37Rv基因组编码，用其作为亚单位疫苗与多个蛋白疫苗比较或与其他基因疫苗比较[4