质粒克隆等实验.doc

1.PCR反应
取1µl逆转录产物为模板，在25µlPCR扩增反应体系中先将模板于97℃变性5min（热启动过程），加入TaqDNA聚合酶，在PE2400PCR热循环仪中循环35次。
PCR反应体系：
ddH2O：15.5µl
10缓冲液：2.5µl
Mgcl2:1.5µl
dNTPs(2.5mmol/L)：2.0µl
cDNA模板：1.0µl
上游引物(10pmol/µl)：1.0µl
下游引物(10pmol/µl)：1.0µl
TaqDNA聚合酶（5u/µl）：0.5µl

循环参数：94℃，30s；X℃，30s；72℃，1min；循环35次，最后一个循环在72℃延伸7min。

2.PCR产物经琼脂糖电泳纯化和胶回收（参照胶回收试剂盒说明）

3.PCR产物直接与商品化T载体连接。
连接体系：10µl中：PCR产物7.5µl
4℃,过夜
或16℃，8h
T载体0.5µl
10ligasebuffer1.0µl
T4ligase1.0µl
DNA片段的连接
DNA片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4DNA连接酶连接(5′末端浓度为0.1-1.0μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切
4.转化
10µl连接产物与200µl感受态细胞混匀，冰浴30min，
42℃水浴90s，迅速冰浴2min，
加入600µlLB（无Amp），37℃培养45-60min，3,600rpm离心5min，弃650µl，剩余部分重新悬浮，铺板接种，37℃培养12-16hr。
下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。３）于４℃用SorvallGS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。５）以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/LCaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５]注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤11]b.c]]。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。９）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。10）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。12）每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45