丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究费.pdf

346中国科学C辑生命科学2006,36(4):346~354

丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与
免疫原性研究*

**
高军龚育平赵平杨晓平戚中田

(第二军医大学,上海200433)

摘要丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异,尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性
最大.模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性,保守的T细胞表位具有各型
间的相对保守性.为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍,我们选取HCVE2区HVR1(384～
410aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44aa,132～140aa)、NS3区保守的
CTL表位1条(1073～1081aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa1251～1259),各表位之间以插入
3个氨基酸为连接臂,人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc).将mfc与
gst基因融合,表达了多表位抗原蛋白GST-MFC.同时,构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表
位基因和mfc基因串联的候选HCVDNA疫苗,即质粒pVAX1.0-st-mfc.以GST-MFC蛋白免疫
家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠,采用ELISA和Westernblot方法,应用10条具有代表性
的HCVHVR1合成肽进行检测,证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应,交叉反应
率(crossreactivity,CR)为90%.应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进
行反应,证明其反应识别率(reactivityfrequency,RF)为75%.上述结果表明,筛选合成的HCV多
表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征,可作为HCV疫苗研制的候选基因.

关键词丙型肝炎病毒多表位肽丙型肝炎病毒高变区1模拟表位T细胞保守表位

丙型肝炎病毒(HCV)的感染呈世界性分布,全发展成慢性,其中约20%可发展为肝硬化,1%～4%
球HCV感染率约为3%,约1.7亿人感染HCV,每年可发展为肝癌.丙型肝炎治疗常用干扰素和利巴韦
新发丙型肝炎病例约3.5万例.我国一般人群抗林,其应答率约为40%.由于HCV高度变异、缺乏体
HCV阳性率约为3.2%,急性感染者中约50%～80%外培养系统及无可靠的小动物模型等,HCV疫苗的

收稿日期:2005-06-03;接受日期:2005-12-24

*国家高技术研究发展计划(863计划,2002AA214161)和国家自然科学基金(批准号:30471596)资助项目

**联系人,E-mail:[e-mail]

SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences

第4期高军等:丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究347

研究困难重重.如何突破常规疫苗研究方法,研制1.2多表位抗原基因的串联合成、表达和DNA
出具有广泛交叉保护性的疫苗,是目前HCV研究的疫苗的构建
热点之一[1~4]
.应用兼顾pichia酵母偏性密码子和大肠杆菌偏
HCV基因组E2区的N端存在一个由27个(384～
性密码子来设计基因,各个模拟B细胞表位之间和B
410aa)氨基酸组成的高变区1(HVR1).研究表明,
细胞表位与细胞T表位之间,以GPG(甘氨酸-脯氨酸-
HVR1区含有HCV主要的中和表位,但自然状况下为
甘氨酸)作为连接臂分开,因为脯氨酸可在两个小氨
株特异性,而且,在免疫压力下此区段极易发生变异,
基酸间形成钢性扭转,从而保证各个B细胞表位的相
导致HCV免疫逃逸[5,6].Puntoriero等人[7]采用噬菌体
对独立.同时,在各个T细胞表位之间,以AAY(丙氨
展示肽库技术,以不同丙肝患者的血清对肽库进行
酸-丙氨酸-酪氨酸)作为连接臂分开,因为这个序列
筛选,鉴定出了具有交叉反应性的多条HVR1模拟B
具有优先被蛋白酶切割的特点,有利于T表位的独立
细胞表位.这些模拟B细胞表位的合成肽不仅可以被
提呈.设计合成的mfc基因长969bp,为了便于合成
不同的HCV感染者血清抗体识别,具有很高的反应
及克隆在基因的端引入Ⅰ和Ⅰ
识别率(reactivityfrequency,RF),而且,免疫动物的,mfc5′BamHEcoR
酶切位点中间处从第一个密码子起引入
血清可以与不同型别的HVR1合成肽发生交叉反应,,561bp()
具有较高的交叉反应率(crossreactivity,CR),表明KpnⅠ酶切位点,3′端引入NotⅠ和SalⅠ酶切位点,
HVR1模拟B细胞表位合成肽具有用于HCV疫苗研究以KpnⅠ酶切位点分为A、B两段分别合成,合成策
的前景.同时,越来越多的实