冻干甲型肝炎减毒活疫苗.doc

冻干甲型肝炎减毒活疫苗
DongganJianxingGanyanJianduHuoyimiao
HepatitisAVaccine（Live），Freeze-dried

本品系用甲型肝炎(简称甲肝)病毒减毒株接种人二倍体细胞，经培养、收获、提纯病毒、加入适宜稳定剂后冻干制成，用于预防甲型肝炎。
1基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物、等应符合“凡例”有关要求。
2制造
2.1生产用细胞
生产用细胞为人二倍体细胞（2BS株、KMB17株或其他批准的细胞株）。
2.1.1细胞库管理及检定
应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管,经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。
2BS株原始细胞库细胞代次应不超过第14代，主细胞库细胞代次应不超过第31代，工作细胞库细胞代次应不超过第44代。KMB17株原始细胞库细胞代次应不超过第6代，主细胞库细胞代次应不超过第15代，工作细胞库细胞代次应不超过第45代；
2.1.2细胞制备
取工作细胞库中的1支或多支细胞管，复苏后混合培养，成单层后，用适宜浓度的胰蛋白酶消化，置37±0.5℃静置或旋转培养。
2.2毒种
2.2.1名称及来源
生产用毒种为甲型肝炎病毒H2或L－A－1减毒株。
2.2.2种子批的建立
应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
H2减毒株原始种子批传代应不超过第7代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第14代，生产的疫苗病毒代次应不超过第15代；L－A－1株原始种子批传代应不超过第17代，主种子批应不超过第18代，工作种子批应不超过第26代，生产的疫苗病毒代次应不超过第27代。
2.2.3种子批检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。
2.2.3.1鉴别试验
用甲型肝炎病毒特异高效价免疫血清与500~1000CCID50／ml甲型肝炎病毒等量混合，置37℃水浴60分钟，接种人二倍体细胞，置35℃培养至病毒增殖高峰期，提取甲型肝炎病毒后用酶联免疫法测定，经中和的培养物检测结果应为阴性（证明甲型肝炎病毒应完全中和），未经中和的病毒液检测结果应为阳性（应证明为甲型肝炎病毒）。
2.2.3.2病毒滴定
将毒种作10倍系列稀释，取至少3个稀释度，分别接种人二倍体细胞，置35℃培养至病毒增殖高峰期，收获后提取甲型肝炎病毒，用酶联免疫法进行病毒滴定，病毒滴度应不低于6.50LgCCID50/ml。
2.2.3.3无菌检查
依法检查（附录XⅡA），应符合规定。
2.２.３.4支原体检查
依法检查（附录XⅡB），应符合规定。
2.2.3.5病毒外源因子检查
依法检查（附录XⅡC），应符合规定。供试品可不经甲型肝炎病毒抗特异性免疫血清中和，直接接种小鼠观察。
2.2.3.6免疫原性检查
用主种子批制备原疫苗，按常规接种甲型肝炎易感者至少40名，分别于免疫前及免疫后6~8周采血，血清抗体阳转率应不低于90%。
2.2.3.7猴体安全及免疫原性试验
用主种子批制备的疫苗做猴体试验。取甲型肝炎病毒抗体阴性、丙氨酸氨基转移酶指标正常、体重为1.5-4.5kg的健康恒河猴或红面猴5只，于下肢静脉注射疫苗1.0ml，滴度应不低于6.50LgCCID50／ml。试验猴于第0、4、8周肝穿刺做组织病理检查。于第0周、第2周、第3周、第4周、第6周、第8周采血测定丙氨酸氨基转移酶及甲型肝炎病毒抗体。应设2只猴为阴性对照。
试验组符合下列情况者判定合格：
（1）至少4只猴抗体阳转；
（2）血清丙氨酸氨基转移酶有一过性（1周次）升高者不超过2只猴；
（3）肝组织无与接种供试品有关的病理改变。
有下列情况之一者可重试：
（1）接种猴抗体阳转率低于4／5；
（2）抗体阳转前后两周内血清丙氨酸氨基转移酶异常升高超过2次；
（3）试验猴不能排除其他原因所致的肝组织病理改变。
重试后仍出现上述情况之一者，判为不合格。
2.2.4毒种保存
毒种应置-60℃以下保存。
2.3原液
2.3.1细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2培养液
培养液为含适量灭能新生小牛血清的MEM或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合规定（附录XIIID），且甲肝抗体检测应为阴性。
2.3.3对照细胞外源因子检查
依法检查（附录XⅡC），应符合规定。
2.3.4病毒接种和培养
取工作种子批毒种按适宜MOI接种于人二倍体细胞（同一工作种子批应按同一MOI接种），于35±0.5℃培养，培养期间，根据细胞生长情况，可用不少于原倍培养液量的洗液充分洗涤细胞表面以去除牛血清，并换加维持液或其他适宜的液体继续培养。
2.3.5病毒收获物
于病毒增殖高峰期，采用适宜浓度的胰蛋白酶或其他适宜方法消化含甲肝病毒的细胞，