小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型的简历及应用.pdf

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小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型的优化及应用

栾卫卫1，邓玉林1,2∗，董润安1，庆宏1，李良1,2，李伟1,2，戴荣继1,2，禹玉洪1,2
1北京理工大学生命科学与技术学院，北京，（100081）
2北京理工亘元医药技术开发中心有限公司，北京（100081）
摘要：糖尿病已经成为世界范围内危害人类健康的主要疾病之一，对糖尿病的研究和治疗
具有重要意义，本文首先建立并优化小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型，然后使用临
床抗糖尿病药物对该模型进行考察，并对海糖平（H）和杉糖平（S）两种降糖新药
进行了筛选。通过Western－blot法检测GLUT4（葡萄糖转运蛋白4）以确定药物的
药效。结果表明，用临床抗糖尿病药物考察模型能客观反映该药物药效。在此模型上，
对杉糖平和海糖平的各个馏分进行初步筛选，发现了两种药物的一些有效成分。
关键词：2型糖尿病，GLUT4，Westernblot，药物筛选
1．引言

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病,以慢性血糖代谢紊乱为主要特征。胰岛素绝对或
相对不足,引起糖、脂肪、蛋白质和继发性维生素、水、电解质代谢紊乱,常并发动脉粥样硬
化、微血管病变、神经系统病变,从而导致多个系统、多个脏器的损害[1]。如何控制治疗糖尿
病及其并发症是当前世界医学领域重要课题，研制开发有效的治疗糖尿病药物成为生物制药
的重要目标。
近年来，葡萄糖的体内运转成为研究热点，特别是葡萄糖转运蛋白GLUT4[2]。GLUT4主
要分布于脂肪、骨骼肌和心肌组织细胞内，是人和啮齿动物主要的葡萄糖转运体[3]。GLUT4
含量减少或者活性降低，有可能诱发2型糖尿病。因此，通过测定药物诱导细胞膜上GLUT4
量的多少，判断药物是否有促进GLUT4转位作用，初步确定它是否有降糖作用[4-6]。本文建
立了一种Westernblot法，对GLUT4进行定性和定量检测，确定药物的药效。
2．实验部分
2.1药品

胶原酶Ⅷ(SigmaChemicalCo.)，牛血清第五组分（SigmaChemicalCo.）,羊抗兔－HRP,
甲胺（北京经科宏达生物科技公司），兔抗GLUT4（北京赛泰克生物科技公司），其它药品均
属分析级。

2.2脂肪细胞的制备

脂肪细胞取自昆明小鼠（30g±）的附睾脂肪垫。分离方法参照Rodbell[7]，Gliemann[8]和
Marshall[9]方法加以修改。小鼠脂肪垫在无菌条件下取出，剪碎置于消化液中，37℃水浴消化
1h，不时振荡，消化液为KRBHbuffer，包括25mM的Hepes，200nM腺苷，1％牛血清白蛋白
和1.5mg/mL胶原酶。消化完毕后用75目筛网对组织消化液进行过滤，离心两次（1200×g，
1min），取上层脂肪细胞的悬液。

2.3药物与细胞的预温育

将药物加到细胞悬液中，37℃水浴温育40min。

2.4细胞膜的制备

∗通讯联系人：邓玉林电话：[phone]，E－mail：[e-mail]。

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脂肪细胞的质膜按文献方法制备[10-12]，离心管中的细胞悬液在4℃下超声破碎，离心
（3000×g,15min,4℃）弃去表面悬浮的白色脂肪层，悬液继续离心（12000×g，25min，4℃），
沉淀用MediumⅠ(10mMTris-HCl，1mMEDTA，250mM蔗糖，pH7.4)稀释成溶液作为待测
的膜样品溶液。

2.5GLUT4含量测定

GLUT4的含量采用Westernblot的方法测定，其具体操作如下[13-15]：
（1）电泳：采用分离胶浓度为10％，浓缩胶5％进行蛋白分离富集。浓缩胶80V电压，分
离胶120V电压，冰浴中电泳大约1.5h，进行转膜。
（2）转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三眀治夹层安装好，正负极放到电转移装
置，倒入电转移缓冲液，进行电转移。15V,30mA，冰浴下电转移4h。然后用丽春红检验蛋
白是否转移到膜上。
（3）封闭：将膜放入5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜。
（4）与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育2h。
（5）与二抗的反应：用TBS缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次10分钟，
然后加入二抗37℃温育1h。
（6）底物显色：TBS漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次10分钟，然后加入底物进行显
色，定量，拍照保存。

2.6总蛋白浓度的测定

在制备好细胞膜悬液后，膜上总蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定，方法见Timothy[16]所述。

2.7数据分析

所有数据均用±S表示，并用SPSS和Excel统计软件进行数据整理和统计，多组间显著
性差异由t检验比较，P＜0