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第五章PCR技术原理
定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase
chainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的
方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩
增出来的技术。PCR概念的提出引物Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…此酶具有以下特点：

①耐高温，
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。

酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。

在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命
名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)1、PCR技术的基本原理①94℃变性PCR扩增原理
①模板：单链或双链DNA
②引物：16-30bp合成的寡核苷酸
③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶
④底物：四种脱氧三磷酸核苷
（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)
⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂
4.PCR反应程序
⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）
⑵94℃30’’变性
⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）
⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸
⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）
⑺4-10℃保存1）复性和延伸温度
复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。
延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。
2）反应时间
变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。
复性时间有30秒种一般是足够的。
延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。3）循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。

原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。4）PCR反应液的配制
最后加入DNA聚合酶。

早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。总体积50-100l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂
10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，
50mMK+

②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、
dTTP、dCTP和dGTP），
终浓度一般为200mM（即饱和浓度），
dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。
③引物：1μM/L

引物设计的一般原则④模板：单、双链DNA均可。
模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过
高会导致反应的非特异性增加。
⑤DNA聚合酶：
最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度75℃。

PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3‘-5’外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。

6.PCR技术的特点2）特异性3）操作简便易行4）用途广泛1.长片段DNA的PCR扩增
常规PCR长度为2kb以下。
长片段PCR扩增存在的问题：
（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低
（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物
（3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解
（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难
（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度

改进：
(1)改进缓冲体系
(2)采用混合DNA聚合酶
主体使用扩增效率高，延伸能力强的TaqDNA聚合酶；少量使用具有3ˊ5ˊ外切酶活性的高温DNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。2.PCR扩增未知DNA片段
1).染色体步查（移）（chromosomewalking）：
是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。2).反向PCR(inversePCR)扩增原理：已知序列步骤：3).利用接头的PCR步骤：
(1)基因组DNA的限制