PCR原理.doc

PCR
百科名片
PCR是一个英文简称缩写，通常用于很多学术名词的缩写，包括生物学的聚合酶链式反应，电子信息学的光电导继电器，计算机学的程序控制暂存器，电子学的节目时钟参考，口腔行业的术语表膜清洁率。
1.生物学的聚合酶链式反应
定义
聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction），
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聚合酶链式反应
具体内容点击：HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/29641.htm"聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。由美国科学家PE（PerkinElmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在
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聚合酶链式反应
实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
工作原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时
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聚合酶链式反应
间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)
工作步骤
标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次