RNAi的制备和方法.doc

近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由HYPERLINK"http://bbioo.com/Article/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+"转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何进行RNAi试验(一)siRNA的设计
1.在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：HYPERLINK"http://www.genesil.com/business/products/order2.htm"http://www.genesil.com/business/products/order2.htmHYPERLINK"http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html"http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlHYPERLINK"http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html"http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlHYPERLINK"http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710"http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.RNAi目标序列的选取原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.阴性对照一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：HYPERLINK"http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49"ht