鸡胚接种技术.ppt

第二章鸡胚接种技术一、概况
鸡胚培养法的优点：

鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒。
鸡胚是一整体，有神经血管的分布及脏器的构造。
来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。鸡胚培养法的缺点：

一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指征。
卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。
某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传递到鸡胚。
通常鸡胚含有白血病病毒。
在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵抗。第一节鸡胚的结构与生理卵壳与壳膜
卵壳位于最外层的坚硬壳层；
壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子
交换，因此培养鸡胚需一定的湿度和气体。
气室
功能主要是呼吸和调节压力。
绒毛尿囊膜
壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。
羊膜
胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。尿囊腔
位于绒毛尿囊腔和羊膜之间，胚胎排泄器
官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐，
为减少沉淀，盐水稀释再4℃保存。
卵黄囊
主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养。
卵白
外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养。第二节鸡胚的孵育和检查鸡胚的孵育
—温度为38～39℃；
—湿度为40％-70％；
—翻蛋：防止蛋白粘连，促进羊膜运动和空
气流通；
—通风：排出CO2和吸入O2。检卵

—血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血
管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。

—胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在
转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎
发红像出血样，有的呈现黑块。

—绒毛尿囊膜发育界限：发育好的鸡胚可见
密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，
死胚则见不到这一现象。
第三节鸡胚接种途径及方法接种步骤与方法羊膜腔接种法解剖与收获（二）绒毛尿囊膜接种将孵育l0~13日龄的鸡胚标记气室、胎位，于与胚胎略近气室端卵壳上划一等边三角形。
消毒气室顶端及记号处，用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕，不可弄破下面的壳膜，同时在气室顶端钻一小孔。
轻轻揭去卵壳，露出壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖循卵壳膜纤维方向划破一隙，勿伤及紧贴的绒毛尿囊膜。
用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气，此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上，从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。
在卵壳的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于绒毛尿囊膜上，然后将旋转鸡胚使接种物扩散到整个绒毛膜尿囊膜上。
在卵壳的窗口周围涂石蜡，用消毒胶布封口。将鸡胚保持人工气室在上的位置，33~35℃继续培养48～72h。绒毛尿囊膜接种法解剖与收获（三）尿囊腔接种取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用开孔器钻开一长约2mm小口。
再次消毒钻孔区，接种病毒液0.1～0.2ml，将针头刺入孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。
消毒后用石蜡溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～72h，；于接种后24h内死亡者为非特异性死胚应弃去。尿囊腔接种法解剖与收获（四）卵黄囊接种取5～8日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，钝端朝上，消毒气室端。
用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有6号针头的1m1注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约3cm，注入0.2～0.5ml待接种的病毒于卵黄囊内，随后用胶带或溶化的石蜡封孔。
置孵化箱内继续孵育3～8d，时间长短应根据病毒或立克次体的种类而定，每天翻卵2次，弃掉24h内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡)。卵黄囊接种法解剖与收获三、注意事项第四节病毒的检测直接观察法
—在绒毛尿囊腔形成损害或疱疹:如痘类病毒和
疱疹病毒,常产生白色或灰色痘疱,并有充血；
—引起鸡胚死亡:如新城疫病毒、乙脑病毒；
—造成鸡胚损害和胚胎生长迟缓：马流感病毒。
实验检测法
—血凝试验和血凝抑制试验：流感病毒的存在；
—补体结合试验：腮腺炎病毒；
—其他方法：PCR等。第五节鸡胚接种技术的应用第三章动物试验技术一、实验动物的种类（微生物控制分类）实验动物的遗传学控制分类实验动物的遗传学控制分类二、常用的实验动物三、实验动物常用基本操作技术皮下接种：多用于观察动物病毒感染后的免疫学指标。
腹腔接种：大小鼠接种多用此方法。可用于病毒感染及感染后免疫指征的观察，或作为抗病毒的给药途径。
静脉接种：可造成病毒全身性感染，可观察病毒的致病性或机体对病毒的清除机制。小鼠、大鼠采用尾静脉注射。豚鼠采用前肢皮下静脉注射。兔采用外耳缘静脉注射。实验标本的采集四、使用实验动物的基本原则第二节动物实验在病毒检验中的应用第三节病毒学检验中动物实验的基本步骤第