出口食品_副溶血性弧菌_检验.doc

MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌检验

MM_FS_CNJ_0337
出口食品副溶血性弧菌检验方法

1.适用范围
本方法适用于海产食品中副溶血性弧菌检验，其他食品可参照使用。
2.主要试剂和仪器
2.1.主要试剂（包括培养基）
30g／L氯化钠稀释液：见6.1；
60g／L氯化钠蛋白胨水（PW）：见6.2；
氯化钠多粘菌素B肉汤（SPB）：见6.3；
硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）：见6.4；
氯化钠三糖铁琼脂（TSI）：见6.5；
嗜盐性试验用胰胨水（TB）：见6.6；
胰胨大豆琼脂斜面（TSA）：见6.7；
靛基质试验用培养基（I）：见6.8；
氨基酸试验用培养基：见6.9；
V－P半固体琼脂（VP）：见6.10；
糖类分解试验用培养基：见6.11；
42℃生长试验用培养基：见6.12；
O／F试验用培养基（HLGB）：见6.13；
神奈川现象试验用我妻氏琼脂（WA）：见6.14。
2.2.仪器
试管：17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm；
吸管：1mL、10mL；
培养皿：直径90mm；
广口瓶或三角瓶；
电动均质器；
电动试管振荡器；
37℃恒温箱；
42℃恒温水浴箱；
试管架。
3.过程简述
3.1.样品制备
3.1.1.冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2～5℃不超过18h解冻。若不能及时检验，应放于－15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6～10℃冰箱保存，在24h内检验。
3.1.2.取样：以无菌操作进行。
3.1.2.1.鱼类：取鱼体不同部位。
3.1.2.2.贝类：取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类，则应先在清洁的流水中洗刷净外壳，然后以无菌操作打开贝壳，取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
3.1.2.3.甲壳类：取包括鳃及肠的部分或整体。
3.1.3.以无菌操作称取50g检样放于均质杯中，以灭菌剪刀充分剪碎。
3.1.4.加30g／L氯化钠稀释水450mL，均质（8000r／min）1min，使成1∶10稀释液（如无均质器，则应以剪刀尽量剪碎，加450mL稀释水使成1∶10稀释液，并充分振荡）。
3.1.5.用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入装有9mL30g／L氯化钠稀释水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。
3.1.6.每一稀释度换取1支1mL灭菌吸管，按上项操作顺序进行10倍递增稀释。稀释倍数要依据有关标准、规定、要求或样品污染情况而定。
3.2.增菌培养和分离
3.2.1.对新鲜样品，可选择3个连续适宜的稀释度，分别以1mL无菌吸管各吸取1mL稀释液，接种10mL单料氯化钠多粘菌素B肉汤中，进行选择性增菌培养，每一稀释度接种3管（若选择的稀释度为接种1g样品时，则应以10mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，接种10mL双料氯化钠多粘菌素B肉汤中）。
对经加热、辐射处理或冷藏、冻结的样品，可按以上操作先将样品接种于60g／L氯化钠蛋白胨水于37℃前增菌18～24h，然后将培养物以接种环转种到氯化钠多粘菌素B肉汤中进行选择性增菌。
3.2.2.37℃培养18～24h。
3.2.3.氯化钠多粘菌素B肉汤管如有菌生长，则以3mm直径接种环分别取一环菌液，划线于硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）平板上。
3.2.4.37℃培养18～24h。
3.2.5.副溶血性弧菌在蔗糖琼脂（TCBS）平板上的典型菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，多数具尖心、斗笠状，蓝绿色菌落，直么2～4mm。
3.3.生化鉴定
3.3.1.在蔗糖琼脂（TCBS）平板上如出现典型或可疑菌落，每个平板至少挑取两个菌落，每个菌落分别顺次接种到下列培养基进行鉴别试验。
3.3.1.1.无盐胰胨水。
3.3.1.2.30g／L氯化钠胰胨水。
3.3.1.3.氯化钠三糖铁琼脂：先穿刺后划线。
3.3.2.37℃培养18～24h。
3.3.3.选取在氯化钠三糖铁斜面上产碱，在底层产酸，不产气，不产硫化氢；在无盐胰胨水中几乎不生长；在30g／L氯化钠胰胨水中生长旺盛的菌株进行革兰氏染色，镜检，副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，两端浓染、无芽胞。如符合，继续进行以下生化鉴定。
3.3.3.1.嗜盐性试验：各取一环30g／L氯化钠胰胨水培养物，分别接种到70g／L及100g／L氯化钠胰胨水中，37℃培养18～24h。
3.3.3.2.细胞色素氧化酶试验：取一环30g／L氯化钠胰胨水培养物划线到胰胨大豆琼脂斜面上，37℃培养18～24h。
3.3.3.3.靛基质试验：在3.3.1.2的30g／L氯化钠胰胨水培养物中加靛基质试剂后观察反应。
3.3.3.4.赖氨酸脱