扫描电镜生物样品制备技术.ppt

第五章扫描电镜生物样品制备技术第一节常规生物样品SEM制备技术FeaturesofSEMFeaturesofSEMFeaturesofSEMFeaturesofSEM材料学土聚水泥制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品表面的微细结构。生物样品的特性扫描电镜生物样品要求：

不含水份
具有较高的二次电子发射率
良好的导电性
耐热性
最大限度的保持样品的形貌扫描电镜样品常规制备的操作程序

1.取材
2.清洗
3.固定
4.脱水
5.干燥（置换）
6.粘托
7.镀膜（导电处理）一、取材

要点：
确定观察样品的目标

要求及注意事项：
做好充分准备（试剂、仪器、器械等）
保护观察面，作好标记
速度要快，每次取材数量不宜过多
大小要合适10×10×5毫米
避免拉割、挤压二、清洗

目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面

方法：物理方法:漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。
化学方法:用酶消化法

注意事项：
在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面
不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等
不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型清洗液的选择三、固定

目的：
保存样品表面的真实结构；
硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤；
提高样品的二次电子发射率；
提高样品的耐热性和导电性。

常用的固定剂：2.5%戊二醛（1～3h)
1.0%四氧化锇(30’~1h)

固定温度：室温，一般以4℃为宜。四、脱水

要求：不改变样品的体积和表面积的情况
下，去除样品中的水份。

常用的脱水剂：乙醇、丙酮

方法：梯度脱水

时间：视样品大小而定

注意事项：避免裸露，夹伤五、干燥

目的：去除样品中的脱水剂

方法：空气干燥法、冷冻干燥法、
叔丁醇干燥法、临界点干燥法等

常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法空气干燥法冷冻干燥法
临界点干燥法
原理：利用物质在临界状态时，气相与液相
的界面消失，样品在没有表面张力的
情况下进行干燥。
步骤：脱水置换（醋酸异戊酯）
预冷放入样品
注入液态CO2CO2置换
CO2加温气化排除CO2
温度：31.4度
压力：73个大气压临界点干燥法Comparisonbetweencriticalpointdryingandairdrying六、粘托

SEM样品在干燥处理或金属镀膜之前，需用特制导电胶或双面胶将样品粘贴在金属样品台上。
导电胶一般具有黏着力较强、容易挥发固化、干燥后表面电阻率低、导电性能好等特点。

要点：稳，钝角样品粘托
Fixingthespecimen
七、镀膜（样品的导电处理）

目的：使样品导电，增加二次电子的发射率

金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法真空喷镀法

方法：在高真空中使金属加热蒸发，在
样品表面沉积形成一层金属膜。

缺点：金属损耗大，容易产生污染和热
损伤，容易形成“死角”。离子溅射法
原理：
利用气体在低真空中的辉光放电所产生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属膜。离子溅射的优点：
要求的真空低
工作温度低
金属粒子无方向
连续的、厚度均匀甲虫3kV大肠杆菌尿酸钠结晶上左：兔肾小体细胞
上右：血细胞发生
下图：十二指肠绒毛SEM觀察苗木下表皮氣孔分佈及葉部組織之微細構造
A：氣孔密度(橫線=120mm)
B：氣孔形態(橫線=12mm)
C：葉組織(橫線=120mm)SEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造SEM觀察A.scrobiculata孢子之外觀形態
(橫線=60mm)接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造
(A：橫線=30mm；B：橫線=12mm)T松材線蟲頭部口針白粉病分生孢子第二节扫描电镜特殊样品制备技术

特殊生物样品制备主要有：
（1）管道铸型样品
（2）冷冻断裂样品
（3）游离细胞样品
（4）组织消化样品
1.管道铸型样品

用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器的立体结构关系和内表面结构。

铸型方法:铸型剂灌入管腔硬化成型后将组织腐蚀去掉处理铸型进行观察

铸型处理：干燥喷镀观察2冷冻断裂样品
用于实质性脏器内部组织结构的研究，观
察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间
的关系。
步骤：取材固定清洗防冻冷冻
包埋割断软化后固定导电
及终末固定脱水临界点干燥
镀膜观察
要求：取材迅速，大小为1×1×5mm，用具要
预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要
快，外力要轻
3游离细胞样品

样品制备要点：

将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、
固定

步骤：预固定离心