项目报告 DGGE法研究细菌群落结构及多样性分析.doc

北京亿鸣复兴生物

细菌群落结构及多样性实验报告

1材料与方法

1.1样品

2011年2月27日客户提供的12个PCR产物样品。样品编号分别为A0、A1、A2、A3、

A4、A5和B0、B1、B2、B3、B4和B5。

1.2细菌16SrDNA片段的PCR扩增

以客户提供PCR产物为模板，采用引物GC-338F和518R扩增客户提供样品16SrDNAV3

高变区序列。

PCR扩增体系（50μL）为：10×PCRbuffer5μL；dNTP（2.5mM）3.2μL；rTaq（5U/μL）

0.4μL；GC-338F（20mM）1μL；518R（20mM）1μL；模板DNA50ng；补ddH2O至50μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸1min，

30个循环；最终72℃延伸10min。

PCR产物采用OMEGA公司DNAGelExtractionKit纯化回收。

PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶

成像系统。

1.3PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析

取10μLPCR的产物进行DGGE分析。采用变形梯度为40%～60%，浓度为8%的聚丙烯

酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7mol/L和40%（v/v）的去离子甲酰胺）在1×TAE缓冲液

中200V60℃下电泳3小时。

变形梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后，采用银染法染色。

1.6DGGE图谱中优势条带的回收与测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，并回收目的条带中的PCR产物。

以2μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系（50μL）为：10×PCRbuffer5μL；dNTP（2.5mM）3.2μL；rTaq（5U/μL）

0.4μL；F（20mM）1μL；R（20mM）1μL；模板DNA1μL；补ddH2O至50μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30

个循环；最后，72℃延伸10min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到pEASY-T载体上，并转化至DH5α感

受态细胞中，筛选阳性克隆，由北京亿鸣复兴生物科技有限公司对插入的细菌16SrDNA

片段进行序列测定。

2结果与分析

2.1细菌16SrDNA的PCR扩增

以GC-338F/518R为引物扩增细菌16SrDNA序列，得到约200bp的DNA片段（图1）。

图1引物GC-338F/518R扩增样品16SrDNA部分序列电泳检测图

2.2PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）

客户样品16SrDNAPCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析结果如图2。
B0
B1
B2
B3
B4
B5

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12

13


14


15
16
17

18
19
20

图2B样品细菌16SrDNA-PCR产物DGGE电泳图谱
Note：红色数字对应条带为切胶回收条带

2.3主要电泳条带的序列测定及其序列分析

将DGGE电泳图谱中的条带切胶回收后，用引物338F-518R对其进行重新扩增（图3），并

将纯化后的扩增产物连接到pEASY-T载体中。每个回收条带选取3个阳性克隆进行了序列测定，

见表2。

图3引物338F/518R扩增样品细菌16SrDNA部分序列电泳检测图

表2DGGE图谱中主要条带的序列分析

DGGEband
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Nearesttypestrain(accessionNo.)
Unculturedbacterium(AB369002)
Unculturedbacterium(FJ477325)
Acinetobacterbaumannii(CP001172)
Serratiasp.(EU781738)
Dyellayeojuensis(DQ181549)
Ochrobactrumanthropi(FJ374126)
Pseudomonassp.(AJ512401)
Sphingomonassp.(AY177366)
Acinetobacterjohnsonii(GQ169068)
Shewanellasp.(EU073095)
Ochrobactrumgrignonense(FN298272)
Devosiane