一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102533943A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102533943A(43)申请公布日2012.07.04(21)申请号201010581477.5(22)申请日2010.12.10(71)申请人张艳军地址100081北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院植物保护研究所南区(72)发明人张艳军谢明邱卫亮(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书22页页附图附图11页(54)发明名称一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物(57)摘要一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物，它涉及一对用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物。本发明解决了目前缺乏引物用于轮枝菌群落结构DGGE分析的问题。本发明用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物为：正向引物S1(5’-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’)和反向引物A1-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3’)。CN1025394ACN102533943A权利要求书1/1页1.一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物，其特征在于用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物为：正向引物S1：5’-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’反向引物A1-GC：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3’。2CN102533943A说明书1/2页一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物技术领域[0001]本发明涉及一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物，可用于轮枝菌群落结构的DGGE鉴定分析。背景技术[0002]轮枝菌(Verticillium)是自然界广泛存在的一类真菌，其中包括植物病原真菌和昆虫病原真菌。蜡蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)是该属中极有益的一种真菌，包含种类非常丰富，可以感染多种作物上的病原真菌、害虫和病原线虫，已被证实是一种极具潜力的微生物杀虫剂，在欧美、前苏联等国成功应用于温室害虫的生物防治。蜡蚧轮枝菌在轮枝菌群落中的存活规律的阐明，将对指导其在害虫综合防治体系中的应用具有重要意义。昆虫病真菌传统研究方法主要依赖于选择性平板培养和虫饵诱集，然而尚无对蜡蚧轮枝菌敏感的选择性培养基和供试虫体，这严重制约了蜡蚧轮枝菌存活规律的研究。[0003]变性梯度电泳(DGGE)技术由Fischer和Lerman于1979年最先提出，是用于检测DNA突变的一种电泳技术。Myers于1985年首次在DGGE中使用GC发夹技术，可防治DNA片段在DGGE胶中完全解链，DNA片段中每个碱基处的序列差异基本都能被区分开，使DGGE技术日臻完善。与传统的微生物研究方法相比，DGGE的一大优点是能够快速、准确的鉴定各种样品中微生物群落结构演替规律和种群动态，无需对所研究的微生物进行纯种培养。DGGE的另一优点是能够同时对比分析大量的样品，既可比对分析不同微生物群落间的差异，也可研究同一微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。因此，DGGE技术已成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具。发明内容[0004]本发明是为了解决目前缺乏引物用于轮枝菌群落结构DGGE分析的问题，而提供一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物。[0005]本发明用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物为：正向引物S1(5’-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’)和反向引物A1-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3’)。[0006]本发明的引物是根据轮枝菌属真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物S1/A1-GC可扩增出长度为313bp的目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可提供样品中轮枝菌群落结构的信息。附图说明[0007]图1为采用引物S1/A1-GC对样品的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图谱。M泳道为BM2000，1-4号泳道为样品PCR扩增产物，5号泳道为空白对照。[0008]图2为采用引物S1/A1-GC对样品的PCR扩增产物的DGGE电泳图谱。3CN102533943A说明书2/2页具体实施方式[0009]土壤样品DNA提取：称取5g土壤样品和1g玻璃珠至50mL离心管，加入13.5mLDNA提取液(0.1mol/LTrisbase，0.1mol/LEDTA，0.1mol/L磷酸钠，1.5mol/LNaCl，1％CTAB，pH8.0)混合，加入100μL蛋白酶K(1