一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992163A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202211210011.3A61K39/002(2006.01)(22)申请日2022.09.30A61P33/02(2006.01)C12R1/90(2006.01)(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730000甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号(72)发明人王金磊梁勤立王萌李婷婷聂兰碧李雪梅付宝权朱兴全(74)专利代理机构北京维创华成知识产权代理事务所(普通合伙)16094专利代理师石佩(51)Int.Cl.C12N15/79(2006.01)C12N15/30(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N1/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供了一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明通过敲除弓形虫中的TgPP6C基因，最终获得TgPP6C基因缺失的弓形虫弱毒株，与野生株相比，TgPP6C基因缺失的弓形虫弱毒株的体外增殖速度显著下降，致病性显著降低，感染小鼠表现出不发病且不死亡现象，对宿主具有较高的安全性。同时，TgPP6C基因缺失的弓形虫弱毒株免疫小鼠后，产生高IgG抗体水平，对高剂量的弓形虫RH、PYS速殖子和Pru包囊再次感染均能够提供显著免疫保护效力，可用于预防弓形虫的再次感染，是具有巨大应用价值的弱毒活疫苗。CN115992163ACN115992163A权利要求书1/1页1.一种弓形虫弱毒株的构建方法，其特征在于，通过敲除TgPP6C基因来影响弓形虫的胞内增殖和毒力来构建弓形虫弱毒株；所述TgPP6C基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述弓形虫弱毒株的构建方法，其特征在于，所述TgPP6C基因的敲除是利用CRISPR‑Cas9技术来敲除。3.根据权利要求2所述的弓形虫弱毒株的构建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种弓形虫弱毒株，其特征在于，由权利要求1～3任一所述弓形虫弱毒株的构建方法构建。5.一种权利要求4所述弓形虫弱毒株在预防或治疗弓形虫感染的药物中的应用。6.一种弓形虫弱毒活疫苗，其特征在于，包括权利要求4所述弓形虫弱毒株。2CN115992163A说明书1/7页一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用。背景技术[0002]刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可感染包括人在内的几乎所有的温血动物，在世界范围内广泛分布。弓形虫属于机会致病性病原，当人摄取含有弓形虫组织包囊的生肉或被猫粪便中卵囊污染的水之后，卵囊或组织包囊破裂，虫体入侵到肠粘膜细胞，卵囊释放的子孢子或组织包囊释放的缓殖子会转化成速殖子，最终分布到机体的各个部分，造成宿主弓形虫感染。免疫力正常的人感染弓形虫后，在机体免疫系统的作用下，宿主不表现明显的临床症状，但是对于免疫功能低下的病人，比如器官移植病人，艾滋病患者等，弓形虫感染具有很高的风险，甚至导致宿主死亡。现有药物的治疗仅对虫体的速殖子时期起作用，对于包囊内的缓殖子收效甚微，且药物的使用存在一定的毒副作用。[0003]近年来，国内外学者认为开发疫苗免疫宿主可能是防控弓形虫病有效措施。目前，弓形虫病疫苗的研发主要集中在灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等，但此类疫苗仅能为免疫机体提供部分免疫保护力，而无法达到完全保护，免疫保护效果并不理想。弱毒疫苗具有免疫原性好、免疫期长等优点，成为弓形虫病防控的最佳选择之一，但目前仅有一株S48弓形虫弱毒活疫苗被允许在预防山羊和绵羊的流产中应用，但此疫苗仅局限新西兰等国家使用，且遗传背景不清楚。因此，寻找新型有效的疫苗候选抗原进行抗弓形虫病疫苗研发成为防护人类健康的重要任务。发明内容[0004]有鉴于此，本发明目的在于提供一种弓形虫弱毒株及其构建方法和应用，本发明通过敲除弓形虫中的TgPP6C基因，最终获得TgPP6C基因缺失的弓形虫弱毒株，发现低剂量的弓形虫弱毒株即可对弓形虫的急性感染和慢性感染具有免疫保护力。[0005]为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：[0006]一种弓形虫弱毒株的构建方法，通过敲除TgPP6C基因来影响弓形虫的胞内增殖及致病力来构建弓形虫弱毒株；所述TgPP6C基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0007]优选地，所述TgPP6C基因的敲除是利用CRISPR‑Cas9技术来敲除。[0008]优选地，所