与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113637777A(43)申请公布日2021.11.12(21)申请号202111149509.9(22)申请日2021.09.29(71)申请人青岛科技大学地址266000山东省青岛市崂山区松岭路99号(72)发明人李凤梅张慧(74)专利代理机构青岛中天汇智知识产权代理有限公司37241代理人袁晓玲(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6809(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页(54)发明名称与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用(57)摘要本发明属于蟹类分子标记筛选技术领域。针对鳗弧菌感染中华绒螯蟹患病，具体公开了一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌关联的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用，所述分子标记序列如SEQIDNO:3所示，且其852位碱基处存在一个T或C的等位基因突变。以设计SEQIDNO:1所述的正向引物和SEQIDNO:2所述的反向引物的引物对，以鳗弧菌感染中华绒螯蟹基因组DNA为模板扩增CatB基因；设计如SEQIDNO:4所述的正向引物和如SEQIDNO:5所示的反向引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，对目的条带清晰无杂带的PCR产物进行测序筛选得到。本发明中与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记有利于推进中华绒螯蟹遗传育种，为中华绒螯蟹的抗菌选育工作提供新思路。CN113637777ACN113637777A权利要求书1/1页1.一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，且其第852位的碱基为T或C。2.一种扩增权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。3.权利要求1所述与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)用鳗弧菌感染中华绒螯蟹后，提取基因组DNA，以SEQIDNO:1所述的正向引物和SEQIDNO:2所述的反向引物的引物对，以蟹基因组DNA为模板，扩增CatB基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；(b)设计如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示的引物对，以步骤(a)中CatB基因为模板进行PCR扩增反应；(c)经琼脂糖凝胶检测，对步骤(b)中目的条带清晰无杂带的PCR产物进行测序，筛选得到所述SNP分子标记。4.根据权利要求3所述SNP分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(b)中，所述PCR扩增反应体系为：浓度均为10μM的所述正向引物和反向引物各1μL、所述CatB基因模板1μL，Taq酶0.2μL(1U),10×PCR缓冲液2.5μL，MgCl2(25mM)2.5μL，dNTP(10μM)2μL和ddH2O14.8μL。5.根据权利要求3所述SNP分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(b)中，所述PCR扩增反应的程序依次为：95℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃再延伸10min。6.SEQIDNO:3所述序列中的第852处的T/C突变的SNP位点在抗鳗弧菌中华绒螯蟹选育中的应用，所述应用的方式为以SEQIDNO：3所述序列中的第852处的T/C突变位点为SNP位点，扩增鉴定中华绒螯蟹的基因型，筛选基因型为CC的中华绒螯蟹即为抗鳗弧菌中华绒螯蟹。2CN113637777A说明书1/3页与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用技术领域[0001]本发明属于蟹类分子标记筛选技术领域，涉及一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌(Vibrioanguillarum)关联的单核苷酸多态性(SNP)分子标记，特别涉及一种位于中华绒螯蟹组织蛋白酶B(CatB)基因上与抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用。背景技术[0002]中华绒螯蟹是我国重要的水产养殖品种。近年来，由于细菌、真菌和病毒等原因造成中华绒螯蟹的大量死亡，给蟹养殖业造成了巨大的经济损失。弧菌是中华绒螯蟹大量死亡的主要原因。因此，选择高抗性的中华绒螯蟹是一种有效的育种方案。[0003]传统的选择性育种是根据表型来对个体的育种价值进行估计，耗时长，而且总受环境的影响。标记辅助育种是一种基于基因型使用DNA标记进行选择育种的分子方法，使选择更加高效和经济。由于SNP是生物体中最丰富的多态性，因此在各种DNA标记中，SNP成为分子遗传分析的首选DNA标记。从遗传角度出发，SNP分子标记不仅可以评估中华绒螯蟹遗传多样性，还为中华绒螯蟹的抗鳗弧菌选育工作