一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113678732A(43)申请公布日2021.11.23(21)申请号202110941882.1(22)申请日2021.08.17(71)申请人菏泽学院地址274015山东省菏泽市牡丹区大学路2269号(72)发明人尚宏芹高嘉敏张凤云高昌勇(74)专利代理机构北京众允专利代理有限公司11803代理人沈小青(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法(57)摘要本发明涉及植物组织诱导技术领域，尤其涉及一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，针对现有的植物组织诱导技术仍存在诱导率低、组织诱导过程中污染以及褐化的问题，现提出如下方案，其中包括以下步骤：S1：取材并处理，S2：制备培养基，S3：接种诱导愈伤组织，S4：培养维护,S5：继代培养。本发明的目的是通过提高愈伤组织诱导过程中的消毒、灭菌的严格程度降低植物愈伤组织诱导的污染率，同时通过加入营养物质、生长素IAA、生长素类似物、细胞分裂素和2,4‑D，增加了诱导率。CN113678732ACN113678732A权利要求书1/1页1.一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取材并处理：选取牡丹幼嫩的茎、叶或者由种子发芽形成的幼嫩的茎、叶，对选取的茎、叶进行消毒并在超净工作台上对选取的茎、叶进行处理；S2：制备培养基：采用MS培养基，同时加入营养物质、生长素IAA、生长素类似物、细胞分裂素和2,4‑D；S3：接种诱导愈伤组织：将处理后的茎、叶放入培养基进行愈伤组织诱导；S4：培养维护：在进行愈伤组织诱导时，对培养基周围环境进行检测，并对培养基内环境进行设置，维持培养的正常进行；S5：继代培养：通过更换新鲜培养基进行连续培养。2.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S1中，将选取的茎、叶用洗涤剂和清水洗净，并用在70％酒精中浸泡过的纱布擦拭茎、叶表面，然后将茎、叶浸泡在浓度为0.1‑0.2％氯化汞中消毒8‑12min，用无菌水冲洗4‑6遍，冲洗后将茎、叶置于无菌滤纸上吸去表面水分。3.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S1中，先用紫外灯照射超净工作台15min，然后在超净工作台上将消毒的叶使用已消毒的打孔器打成4‑6mm的圆片作为外植体,将已消毒的茎用灼烧并冷却的刀片切成大小均匀的块状作为外植体。4.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S2中，采用的MS培养基中需加入琼脂制备MS固体培养基，并且加入的琼脂质量为总MS培养基质量的0.6‑1％。5.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S2中，加入的营养物质为蔗糖溶液3ml/L、酵母提取物4‑6mg/L、硝酸铁溶液5‑7ml/L,加入的生长素类似物为NAA0.01‑10mg/L、吲哚‑3‑乙酸0.01‑10mg/L，加入的细胞分裂素为KT0.1‑10mg/L、6‑BA0.1‑10mg/L。6.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S3中，将外植体接种到MS培养基进行愈伤组织诱导，接种时在酒精灯火焰旁进行接种，接种后将培养基放在23‑27℃无菌环境中培养直至愈伤组织形成，培养期间每天进行16h光照培养，8h黑暗培养，其中光照强度的范围在1500‑3000lx。7.根据权利要求6所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，将外植体接种到MS培养基进行愈伤组织诱导时采用多组同时诱导，同时设置空白培养基，进行对比培养。8.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S4中，培养过程中要实时对培养基周围环境的湿度和温度进行测定，并在进行培养前通过加入缓冲物质保持培养基pH维持在5.8，其中用pH计对pH进行检测，且加入的缓冲物质包括聚乙二醇、MES缓冲液和天然有机添加物，湿度需保持在50％‑70％。9.根据权利要求1所述的一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述S5中，通过更换新鲜培养基进行连续培养，诱导愈伤组织的培养基要两周更换一次，且更换过程需在无菌环境中将进行。2CN113678732A说明书1/4页一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法技术领域[0001]本发明涉及植物组织诱导技术领域，尤其涉及一种牡丹茎叶愈伤组织诱导方法。背景技术[0002]近年来，我国植物组织诱导技术得到了迅速发展，已经渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域，并广泛应用于农业、林业、园艺、工业、医药业等多种行业，产生巨大的经济效益和社会效益，被认为是一项很有潜力的高新技术，因此，植物组织诱导