基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113930488A(43)申请公布日2022.01.14(21)申请号202111249441.1(22)申请日2021.10.26(71)申请人陕西中医药大学地址712046陕西省西安市西咸新区西咸大道陕西中医药大学(72)发明人刘金辉方亚妮(74)专利代理机构西安智邦专利商标代理有限公司61211代理人汪海艳(51)Int.Cl.C12Q1/6858(2018.01)C12Q1/6883(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表1页附图7页(54)发明名称基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用(57)摘要本发明提供了一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组、试剂盒、方法及应用，适用于体外快速检测MTHFR基因c.677C>T多态性。方法包括以下步骤：(1)互补探针、荧光标记引物和通用下游引物的设计及合成；(2)获取待测样本的基因组DNA；(3)配制反应体系；(4)进行PCR反应；(5)基因型判定。本发明实现了在不需要双标荧光探针的前提下，仅一个反应即完成MTHFR基因c.677C>T多态性检测的目的。CN113930488ACN113930488A权利要求书1/2页1.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：针对MTHFR基因的c.677C>T多态性位点设计，包括以下核苷酸序列的引物和探针：通用下游引物：5’‑GGGACGATGGGGCAAGTGATG‑3’；C荧光标记引物：5’‑荧光基团1‑AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC‑3’其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACC为基础引物序列；T荧光标记引物：5’‑荧光基团2‑AGTGCTATCCGAGGGAAAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT‑3’其中AGTGCTATCCGAGGGAA为互补探针结合序列；AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGACT为基础引物序列；互补探针：5’‑TTCCCTCGGATAGCACT‑猝灭基团‑3’。2.根据权利要求1所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述C荧光标记引物中荧光基团1为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5。3.根据权利要求2所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述T荧光标记引物中荧光基团2为FAM，HEX，ROX，TAMRA，Cy3或Cy5，且与荧光基团1不同。4.根据权利要求3所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于：所述互补探针中猝灭基团为Dabcyl，Eclipse，BHQ1，BHQ2或BHQ3。5.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1‑4任一所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的引物组。6.根据权利要求5所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于：还包括UNG酶(尿嘧啶‑N‑糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCRBuffer。7.一种基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：使用权利要求5或6所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的试剂盒，包括以下步骤：步骤1、获取待测样本的基因组DNA；步骤2、配制反应体系；在同一反应管中加入待测样本的基因组DNA、通用下游引物、C荧光标记引物、T荧光标记引物、互补探针、UNG酶(尿嘧啶‑N‑糖基化酶)、DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)以及PCRBuffer；步骤3、PCR反应；将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行反应；步骤4、基因型判定；PCR反应完成后进行待测样本MTHFR基因多态性的判定。8.根据权利要求7所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于：步骤2中以单管反应体系20μL计，反应管中加入通用下游引物，250～550nM；C荧光标记引物，125～250nM；T荧光标记引物，125～250nM；互补探针，500～700nM；UNG酶，0.2～0.4U；DNA聚合酶，0.5～1U；dNTPs，各150～250μM；dUTP，400～500μM；10×PCRBuffer，2.0μL；基因组DNA，1‑100ng，去离子水补足体积20μL。9.根据权利要求8所述的基于互补探针技术快速检测MTHFR