一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102533928A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102533928A(43)申请公布日2012.07.04(21)申请号201010588933.9(22)申请日2010.12.15(71)申请人中国科学院沈阳应用生态研究所地址110164辽宁省沈阳市沈北新区蒲河新城裕农路72号(72)发明人苏振成胡凤钗李新宇王秀娟张惠文(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人许宗富周秀梅(51)Int.Cl.C12Q1/04(2006.01)C12N1/26(2006.01)权利要求书权利要求书2页2页说明书说明书66页页附图附图11页(54)发明名称一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法(57)摘要本发明涉及污染土壤生物修复技术领域，具体的说是一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法。采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；取富集培养液稀释101-107后，取其中适宜浓度涂布于山梨醇固体培养基上，加芘膜后，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分别点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-2周；将生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。本发明为在实验室中快速筛选多环芳烃降解菌，开发新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。CN1025398ACN102533928A权利要求书1/2页1.一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：1）富集培养，采用逐步提高多环芳烃浓度的方法对以多环芳烃为底物的降解菌进行富集培养；2）分筛培养：取步骤1）中富集培养液稀释101-107后，涂布于山梨醇固体培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，挑取具有降解圈的单菌落分别点种于含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-2周；3）成膜法快速筛选降解菌：将步骤2)中生长的菌株点种于带有多环芳烃膜的无机盐固体培养基上，置于28-32℃恒温培养箱中培养1-3周，能够生长的菌株即为能够以多环芳烃为唯一碳源的降解菌株。2.2.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述步骤1）富集培养：将菌样接种于含多环芳烃的液体无机盐培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为置于28-32℃恒温摇床上180r·min-1培养30天,共转接4-5次,转接量按体积百分比计每次培养液10%接种于含多环芳烃逐渐增加的50ml液体无机盐培养基中,待用；其中含多环芳烃的液体无机盐培养基中多环芳烃首次加入量100㎎·L-1，而后以每次增加100㎎·L-1的速度逐渐增加。3.3.按权利要求1或2所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述多环芳烃是首先溶于丙酮的，按质量体积比(g·ml-1)为1:1000将多环芳烃溶于丙酮中，制成1000㎎·L-1的母液。4.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述含多环芳烃的牛肉膏蛋白胨培养基中的多环芳烃是溶于二甲基亚砜的，按质量体积比(g·ml-1)为1:500将多环芳烃溶于二甲基亚砜中，制成2000㎎·L-1的母液。5.按权利要求1所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述山梨醇固体培养基为：每升山梨醇无机盐培养基中加入1ml维生素母液。6.按权利要求5所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述山梨醇无机盐培养基为每升液体无机盐培养基中加入9g山梨醇，0.5g酵母粉和按培养基总重的2％的琼脂条；所述维生素母液配方为：对氨基苯甲酸200mg，生物素200mg，叶酸200mg，烟酸200mg，泛酸钙100mg，维生素B6100mg，核黄素100mg，硫胺素100mg，维生素B121mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4µm滤膜过滤除菌。7.按权利要求2或6所述的以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于：所述液体无机盐培养基为：NaNO30.5g,(NH4)2SO41.0g,Na2HPO42.5g,KH2PO41.0g,微量元素溶液1ml，钙镁溶液1ml用蒸馏水定容至1000ml；其中，微量元素溶液配方为：Al2(SO4)3·18H2O108mg,CoSO4·7H2O56mg,CuSO4·5H2O56mg,FeSO4·7H2O3.0g,H3BO3611mg,KBr28mg,KI56mg,LiCl28mg,MnCl2·4H2O389mg,Na2MoO4·2H2O28mg,Na2WO4·2H2O28mg,NiCl2·6H2O58mg,Sn