氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102565376A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102565376A(43)申请公布日2012.07.11(21)申请号201010584261.4(22)申请日2010.12.13(71)申请人苏州艾杰生物科技有限公司地址215006江苏省苏州市工业园区宏业路128号B2栋(72)发明人王尔中(51)Int.Cl.G01N33/52(2006.01)G01N21/31(2006.01)G01N21/33(2006.01)C12Q1/48(2006.01)C12Q1/25(2006.01)C12Q1/32(2006.01)权利要求书权利要求书33页页说明书说明书1010页页(54)发明名称氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒(57)摘要本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据氨激酶、丙酮酸羧化酶、牛磺奥品脱氢酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。CN1025637ACN102565376A权利要求书1/3页1.一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述氨激酶、丙酮酸羧化酶、牛磺奥品脱氢酶的系列催化反应完成：氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+牛磺酸+还原型辅酶牛磺奥品脱氢酶牛磺奥品+辅酶+水。2.一种氨(氨离子)的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：2.1样品准备：2.1.1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升；2.1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；2.1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；2.2试剂溶液的制备：分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨激酶、丙酮酸羧化酶、牛磺奥品脱氢酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸、单价磷酸盐与牛磺酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L；2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2.4在与步骤2.3)同样的条件下测定步骤2.1.1)标准样品的吸光度随时间的变化；2.5在与步骤2.3)同样的条件下测定在步骤2.1.3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量：式中：ΔA(样品)表示步骤2.3)得到的待测样品的吸光度变化；ΔA(空白)表示步骤2.5)得到的空白溶液的吸光度变化；ΔA(标准)表示步骤2.4)标准样品的吸光度变化。3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条2CN102565376A权利要求书2/3页件下进行测定：测定方法为终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于：5.1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂：它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸、单价磷酸盐、牛磺酸、氨激酶、丙