一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102776289A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102776289A(43)申请公布日2012.11.14(21)申请号201210281034.3(22)申请日2012.08.09(71)申请人南京市产品质量监督检验院地址210028江苏省南京市玄武区红山路168号(72)发明人张弛(74)专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人胡锡瑜(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书66页页序列表序列表22页页附图附图11页页(54)发明名称一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用(57)摘要本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用。基于两步法半巢式-多重PCR技术，设计了一种用于深加工食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分同时鉴别的高灵敏度试剂盒。经验证，本试剂盒通过使用半巢式-多重PCR技术，在保证检测特异性的前提下，极大地提高了现有以PCR技术为基础的食品物种检测方法的检测灵敏度，其灵敏度相比于普通PCR方法提高了2-3个数量级，比荧光定量PCR方法提高了1-2个数量级。本试剂盒可成功地对PCR、荧光定量PCR不能有效鉴别的肉松、肉丸等深加工食品中的肉类成分进行准确鉴定。CN1027689ACN102776289A权利要求书1/1页1.一种基于半巢式-多重PCR的同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种肉类成分的试剂盒，其特征是由以下试剂构成：（1）预混液1：含引物SIM10.4μM，引物SIM20.4μM，Taq酶1.25U，dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl10mM，KCl50mM，MgCl21.5mM，预混液1储藏条件为4ºC，保质期半年；（2）预混液2：含引物SIM10.4μM，引物P0.4μM，引物C0.4μM，引物B0.4μM，引物S0.4μM，Taq酶1.25U，dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl10mM，KCl50mM，MgCl21.5mM，溴酚蓝5%v/v，预混液2储藏条件为4ºC，保质期半年。2.权利要求1所述试剂盒用于深加工食品中肉类成分的种属鉴定方法，其特征是由以下步骤构成：（1）将从肉松、火腿肠深加工食品中提取的总DNA1μL与19μL本试剂盒中的预混液1在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行第一轮扩增反应，反应条件如下：95ºC预变性3min，20个循环的95ºC30s、54ºC30s、72ºC40s，最后72ºC延伸7min；（2）取2μL反应产物，与48μL本试剂盒中的预混液2在冰上混合均匀后，于普通PCR仪上进行第二轮扩增反应，反应条件如下：95ºC预变性3min，30个循环的95ºC30s、52ºC30s、72ºC40s，最后72ºC延伸7min；（3）取10μL反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，使用100bp至1000bp的DNA分子量标准作为对照，将凝胶在紫外灯下观察、拍照，根据特异性条带的分子量大小对食品中四种肉类的种属进行同时鉴定，鸡、牛、羊、猪的特异性条带大小分别为216bp，263bp，322bp和387bp。3.权利要求1所述试剂盒在现有PCR、荧光定量PCR方法无法鉴别肉类种属的深加工食品进行检测或肉类掺假鉴别中的应用。2CN102776289A说明书1/6页一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用[0001]一．技术领域本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时鉴别食品中猪牛羊鸡四种成分的试剂盒及应用。应用两步法半巢式-多重PCR技术，设计用于深加工食品中鸡、牛、羊、猪同时检测的试剂盒，将其灵敏度相比现有的PCR和荧光定量PCR技术提高1-3个数量级，可用于DNA严重降解的深加工食品中肉类种属的检测。[0002]二．背景技术肉制品的掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。近年来，不法企业在利益的驱使下，使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉等价格相对较高的肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。近期，河南等地又出现了使用鸡肉、鸭肉等冒充羊肉串的事件。肉类食品掺假已成为我国食品质量安全的又一“潜规则”。[0003]以聚合酶链反应（PCR）为基础的技术已成为食品中肉类种属鉴定的核心方法。根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。如今，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR