一种体外高效扩增动物细胞的培养液及其用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103087977A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103087977103087977A(43)申请公布日2013.05.08(21)申请号201310029633.0(22)申请日2013.01.25(71)申请人协和干细胞基因工程有限公司地址300384天津市南开区华苑产业区梅苑路12号(72)发明人洪敬欣韩俊领刘俊江李茜黄文敬(74)专利代理机构天津才智专利商标代理有限公司12108代理人王晓红(51)Int.Cl.C12N5/07(2010.01)C12N5/0775(2010.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书8页说明书8页附图3页附图3页(54)发明名称一种体外高效扩增动物细胞的培养液及其用途(57)摘要本发明公开了一种体外高效扩增动物细胞的培养液及其用途，培养液组成包括：基础培养基DMEM/F12、bFGF、EGF、丙酮酸钠、谷氨酰胺、碳酸氢钠和胎牛血清。本发明的培养液中含有较低的动物血清，具有较高的安全性，配方成分简单、明确，避免因培养基批次间差异，造成所培养的细胞性质不同的可能性，适合细胞产品的产业化。采用本发明培养液培养的动物贴壁细胞体外增殖能力较强且能很好地保持其生物学特性，不仅试用于贴壁的间充质干细胞的培养，也可适用于其他成纤维细胞系和其他细胞系的培养。CN103087977ACN103879ACN103087977A权利要求书1/1页1.一种体外高效扩增动物细胞的培养液，其特征在于，每升培养液包括以下组分：2.根据权利要求1所述的体外高效扩增动物细胞的培养液，其特征在于，所述细胞因子为碱性成纤维细胞生长因子bFGF和表皮生长因子中的一种或两种组合。3.根据权利要求1或2所述的体外高效扩增动物细胞的培养液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。4.权利要求1所述的体外高效扩增动物细胞的培养液用于贴壁生长细胞的培养。2CN103087977A说明书1/8页一种体外高效扩增动物细胞的培养液及其用途技术领域[0001]本发明属于细胞与组织培养领域中的培养液配方，涉及一种低血清、组成成分明确的培养液，该培养液特别适用于体外扩增贴壁细胞。技术背景[0002]细胞培养基是维持体外细胞生存和生长增殖的基础物质，也提供组织细胞营养和繁殖的生存环境。通过改善培养环境，可在较短时间内提高扩增倍数，减少扩增过程中的分化与老化。可分为天然培养基及合成培养基两大类。体外培养细胞所需的营养物质与体内相同。目前市面上销售的合成培养基RPMI1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。动物细胞培养基的基本成分包括氨基酸、碳水化合物、无机盐、缓冲系统、维生素等，所必需的溶液为平衡盐溶液（常用的为Hanks液和Earle液）和PH调整液（3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES溶液）。[0003]在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。[0004]所谓的贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。而悬浮培养是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。如果贴壁细胞长期不贴壁，有可能会死，或者活性降低。[0005]目前较为常用的贴壁细胞培养基有以下几种：RPMI1640、MEM、DMEM、DMEM/F12及无血清培养基。[0006]（1）RPMI1640：RPMI1640是由Moor等研究成功的，最初为培养小鼠白血病细胞的需要而制备。开始的配方特别适合悬浮细胞的生长，主要针对淋巴细胞，后经几次改良从RPMI1630、1634，而至RPMI1640。其组成较为简单，但可以适应很多种类型细胞的生长。[0007]（2）MEM：MEM培养基是由Eagle’s基础培养基（BME）发展而来的，是将其中的氨基酸和维生