鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103320402A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103320402103320402A(43)申请公布日2013.09.25(21)申请号201310200007.3(22)申请日2013.05.27(71)申请人北京中科研源科技发展有限公司地址100190北京市海淀区中关村东路80号(72)发明人梁巍杜澄钟良玮(51)Int.Cl.C12N9/02(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书5页说明书5页附图4页附图4页(54)发明名称鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法(57)摘要本发明涉及一种酶的提取纯化工艺，具体是从鸡肝脏中提取纯化硫氧还蛋白还原酶的方法。所说的从鸡肝脏中提取纯化硫氧还蛋白还原酶的方法是先从新鲜鸡肝脏中获得粗提液，再经盐析后，选用DEAE阴离子交换层析柱以及ADP亲和层析柱两种层析介质，采用色谱法从鸡肝中分离和纯化鸡硫氧还蛋白还原酶。本发明使用的原料鸡肝来源广、成本低，提取纯化的过程工艺简单、操作容易，得到的成品纯度高，具有和牛、鼠硫氧还蛋白还原酶一样的催化人Trx还原的能力，因此可以很好的应用于科研实践，代替它们进行人类相关疾病的研究，同时很好地解决了牛、鼠TrxR提取过程中的原料获取困难、个体差异大等问题。该方法既可以填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。CN103320402ACN10324ACN103320402A权利要求书1/1页1.一种鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法，其特征在于采用如下步骤：(1)首先取刚宰杀的肉鸡肝脏，冻存到-80℃备用，切碎后加入事先4℃预冷的磷酸钾-EDTA缓冲液匀浆，离心除去不溶性成分后，得到可溶性总蛋白；(2)用25％～85％硫酸铵盐析，离心收集蛋白沉淀；(3)蛋白沉淀用事先4℃预冷的磷酸钾-EDTA缓冲液全部溶解，并用磷酸钾-EDTA缓冲液透析除盐；(4)先后对蛋白溶液进行热处理和酸处理，离心除去对热、对酸敏感的杂蛋白，随后将蛋白溶液pH重新调为7.5；(5)将得到的蛋白上清液上样到事先用磷酸钾-EDTA缓冲液平衡的DEAE阴离子交换层析柱，用同样的缓冲液冲洗杂蛋白。用磷酸钾-EDTA缓冲液和含NaCl的磷酸钾-EDTA缓冲液进行连续梯度洗脱，收集所有含蛋白的洗脱液，用DTNB测定法分别测定它们的TrxR活性，选取活性高的部分合并，用磷酸钾-EDTA缓冲液透析；(6)透析后的蛋白溶液上样到事先用磷酸钾-EDTA缓冲液平衡的ADP亲和层析柱，用同样的缓冲液冲洗杂蛋白。用磷酸钾-EDTA缓冲液和含NaCl的磷酸钾-EDTA缓冲液进行连续梯度洗脱，收集所有的洗脱液，用DTNB测定法测定TrxR活性后，选取活性高的部分合并，用磷酸钾-EDTA缓冲液透析。透析后的蛋白溶液用同样的方法再进行一次ADP亲和层析，洗脱后收集的蛋白样品透析除盐后，超滤浓缩至蛋白浓度为1mg/ml左右；(7)对最终的产物进行活性测定、蛋白浓度测定和电泳鉴定；(8)收集的鸡硫氧还蛋白还原酶液分装后保存到-80℃冰箱备用。2.根据权利要求1所述的鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中选用25％～85％的硫酸铵进行盐析，步骤(4)中热处理优选水浴，酸处理优选将溶液pH调为6.5以下，步骤(5)中使用DEAE阴离子交换层析柱，洗脱时所用NaCl的浓度范围为0～0.4M，步骤(6)中使用ADP亲和层析柱，洗脱时所用NaCl的浓度范围为0～0.5M，以及步骤(6)中进行了两次ADP亲和层析。2CN103320402A说明书1/5页鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法技术领域[0001]本发明涉及一种酶的提取纯化工艺，具体是从新鲜鸡肝中分离纯化硫氧还蛋白还原酶的方法。背景技术[0002]硫氧还蛋白系统(thioredoxinsystem)是生物体内重要的氧化还原调节系统，参与细胞信号转导、防御氧化应激、调节生长等过程。硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase，TrxR)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleotide2′-phosphate，NADPH)组成，其中硫氧还蛋白还原酶催化NADPH向Trx的电子传递，在该系统中发挥核心作用。硫氧还蛋白还原酶是吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶家族的成员，在不同的生物中结构差异较大，但都是同型二聚体，每个亚基上各有一个NADPH结合位点、FAD辅酶和氧化还原活性位点，而哺乳动物的硫氧还蛋白还原酶还有一个额外的位于C末端的含硒半胱氨酸的氧化还原活性位点。[0003]目前的研究发现，硫氧还蛋白还原酶与糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤、癌症、阿尔茨