一种乙醛-DNA加合物的测定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105911163A(43)申请公布日2016.08.31(21)申请号201610226317.6(22)申请日2016.04.13(71)申请人国家烟草质量监督检验中心地址450001河南省郑州市高新区枫杨街2号(72)发明人陈欢侯宏卫胡清源刘鲁娟朱贝贝陈建王红娟(74)专利代理机构郑州中民专利代理有限公司41110代理人姜振东(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种乙醛-DNA加合物的测定方法(57)摘要一种乙醛-DNA加合物的测定方法，即DNA中Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法，包括采用乙醛溶液暴露小牛胸腺DNA并加入精氨酸作为反应的催化剂，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标、还原剂NaBH3CN和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液并引入LC-MS/MS系统分析，可准确检测出Et-dG和Propano-dG的含量水平。本发明为全新的DNA中乙醛-DNA加合物的测定方法，采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。CN105911163ACN105911163A权利要求书1/1页1.一种乙醛-DNA加合物的测定方法，即N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200μL超纯水复溶，用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50μg/mL；b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500μL的10mMTris-HCl/5mM2MgCl2缓冲液中，加入30mg的还原剂NaBH3CN，将N-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）还原成N2-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）来检测，加入20μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经1mL甲醇活化和1mL超纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1mL超纯水和1mL10%的甲醇水淋洗，最后用1mL50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液；c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的N2-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）、1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）标准工作溶液；d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。2.根据权利要求1所述的乙醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤a中的乙醛溶液用0.1M的PBS溶液配制，浓度0.00-1mM。3.根据权利要求1所述的乙醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤b中所述混合1515内标为100ng/mL的[N5]Et-dG和[N5]Propano-dG。4.根据权利要求1所述的乙醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤d中选取了ThermoAcclaimTMPolarAdvantageIIC18色谱柱，规格4.6×150mm，3μm，流动相体系选取甲醇A和纯水溶液B，等度洗脱，分析时间为15min，进样量为5μL。5.根据权利要求4所述的乙醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：等度洗脱条件为：0-15min：35%A；流速为0.40mL/min。6.根据权利要求1所述的乙醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤d中串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20psi，雾化气为70psi，干燥气为75psi，碰撞气为9psi，射入电压：10V，碰撞能：9eV，驻留时间：200ms；监测离子对为Et-dG：296.2→180.2定量15离子对，296.2→117.2定性离子对；内标[N5