样品制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106232834A(43)申请公布日2016.12.14(21)申请号201580020737.2(74)专利代理机构北京同立钧成知识产权代理有限公司1(22)申请日2015.02.191205代理人彭雪瑞臧建明(30)优先权数据1403096.92014.02.21GB(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2016.10.20(86)PCT国际申请的申请数据PCT/GB2015/0504832015.02.19(87)PCT国际申请的公布数据WO2015/124935EN2015.08.27(71)申请人牛津纳米孔技术公司地址英国牛津郡(72)发明人詹姆斯·安东尼·克拉克马里恩·路易丝·克劳福德权利要求书4页说明书39页詹姆斯·怀特序列表75页附图19页(54)发明名称样品制备方法(57)摘要本发明涉及表征模板多核苷酸的改进方法。所述方法包括使用聚合酶制备修饰的多核苷酸，所述修饰的多核苷酸使得表征所述模板多核苷酸变得更容易。CN106232834ACN106232834A权利要求书1/4页1.一种表征模板多核苷酸的方法，包括：a)在聚合酶使用所述模板多核苷酸作为模板形成修饰的多核苷酸的条件下，将所述模板多核苷酸与所述聚合酶和自由核苷酸的组接触，其中当形成所述修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的一种或多种核苷酸物质；b)将所述修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得所述修饰的多核苷酸移动穿过所述孔；和c)随着所述修饰的多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述修饰的多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述模板多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中如果所述模板多核苷酸是RNA，所述聚合酶不形成互补的多核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中当形成所述修饰的多核苷酸时，所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的两种或多种所述核苷酸物质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚合酶用不同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的所述两种或多种核苷酸物质中的每一个。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚合酶用相同的核苷酸物质取代所述模板多核苷酸中的所述两种或多种核苷酸物质中的每一个。6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：(a)所述模板多核苷酸是DNA，并且所述模板多核苷酸中的所述核苷酸物质包括脱氧腺苷单磷酸(dAMP)，脱氧鸟苷单磷酸(dGMP)，脱氧胸苷单磷酸(dTMP)，脱氧胞苷单磷酸(dCMP)和脱氧甲基胞苷单磷酸；或(b)所述模板多核苷酸是RNA，并且所述模板多核苷酸中的所述核苷酸物质包括腺苷单磷酸(AMP)，鸟苷单磷酸(GMP)，尿苷单磷酸(UMP)，胞苷单磷酸(CMP)和5-甲基胞苷单磷酸。7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：(a)所述模板多核苷酸是DNA，并且所述修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于脱氧腺苷，脱氧鸟苷，胸苷，脱氧胞苷或脱氧甲基胞苷的核苷；或(b)所述模板多核苷酸是RNA，并且所述修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物质包含不同于腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶，胞嘧啶或甲基胞嘧啶的碱基和/或包含不同于腺苷，鸟苷，尿苷，胞苷或甲基胞苷的核苷。8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质包含次黄嘌呤，4-硝基吲哚，5-硝基吲哚，6-硝基吲哚，甲酰基吲哚，3-硝基吡咯，硝基咪唑，4-硝基吡唑，4-硝基苯咪唑，5-硝基吲哚，4-氨基苯并咪唑或苯基(C6-芳族环)。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述不同的核苷酸物质包含2'-脱氧肌苷，肌苷，7-去氮-2’-脱氧肌苷，7-去氮-肌苷，2-氮杂-脱氧肌苷，2-氮杂-肌苷，2-O’-甲基肌苷，4-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，4-硝基吲哚核糖核苷，5-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，5-硝基吲哚核糖核苷，6-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，6-硝基吲哚核糖核苷，3-硝基吡咯2'-脱氧核糖核苷，3-硝基吡咯核糖核苷，次黄嘌呤的无环糖类似物，硝基咪唑2'-脱氧核糖核苷，硝基咪唑核糖核苷，4-硝基吡唑2'-脱氧核糖核苷，4-硝基吡唑核糖核苷，4-硝基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷，4-硝基苯并咪唑核糖核苷，5-硝基吲哚2'-脱氧核糖核苷，5-硝基吲哚核糖核苷，4-2CN106232834A权利要求书2/4页氨基苯并咪唑2'-脱氧核糖核苷，4-氨基苯并咪唑核糖核苷，苯基C-核糖核苷，苯基C-2’-脱氧核糖基核苷，2'-脱氧水粉蕈素，2'-脱氧异鸟苷，K-2'-脱氧核糖，P-2'-脱氧核糖和吡咯烷。1