牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106771182A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611069263.3(22)申请日2016.11.29(71)申请人中国兽医药品监察所地址100081北京市海淀区中关村南大街8号(72)发明人丁家波冯宇朱良全蒋卉彭小薇王芳张磊(74)专利代理机构北京君智知识产权代理事务所(普通合伙)11305代理人郑明(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N21/31(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图2页(54)发明名称牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒(57)摘要本发明涉及牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒。本发明将提纯的布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)经定量后包被96孔酶标板，免疫健康绵羊制备阳性血清，非免疫健康绵羊制备的阴性血清和HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记羊抗牛IgM抗体稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测羊血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。本发明在常规提取LPS方法中，增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提；采用标准曲线和OD529nm吸光度值相结合的方法检测LPS纯度；采用试管凝集试验对阳性血清进行了效价标定；对主要试剂配方的改进和优化，控制反应背景，缩短了高通量检测的时间。CN106771182ACN106771182A权利要求书1/1页1.一种牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的布鲁氏菌脂多糖(LPS)作为包被抗原，以人工免疫健康牛制备阳性血清，以采集健康非免疫绵羊血清作阴性血清，以HRP标记羊抗牛IgM抗体、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记兔抗羊IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测牛血清中的光滑型布鲁氏菌IgM亚型抗体。2.权利要求1所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于阳性血清的制备和标定方法是：用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的15月龄成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛；对筛选的阴性牛用布鲁氏菌参考强毒株A19灭活抗原以5×1010CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价为2000IU/ml；静脉放血，分离血清，用羊布病阴性血清与效价为2000IU的阳性血清等体积5倍稀释，将其效价调整为400IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，作为试剂盒中布病阳性血清。3.权利要求1所述牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒的应用，其特征在于使用该试剂盒能对牛布鲁氏菌病早期感染进行高通量检测。2CN106771182A说明书1/9页牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。技术背景[0002]布鲁氏菌病(布病)是一种严重威胁人类健康的世界性重要人畜共患病，可感染人、多种家畜和野生动物，主要表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损伤等。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要。[0003]布鲁氏菌抗体检测中的国际贸易指定试验主要有虎红平板凝集试验(RBT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。荧光偏振试验(FPA)是国际贸易中选择试验。目前我国《布鲁氏菌病防治技术规范》中规定的牛布鲁氏菌抗体检测方法为：先经虎红凝集试验(RBPT)初步检测，再经试管凝集试验(SAT)或补体结合试验确诊。试管凝集试验不仅操作复杂，耗时长，而且也存在特异性不高的问题；补体结合试验是公认的确诊方法，但是试验操作复杂，需有良好的试验设施和训练有素的人员作准确的组分滴定、试剂保存和结果判断。荧光偏振试验(FPA)对实验条件和操作技术要求都较高。[0004]ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，该方法解决了常规方法耗时费力的不足，提高了检测的特异性、敏感性和便捷性。申请人已经成功开发了牛布鲁氏菌病ELISA诊断试剂盒，不仅申请了国家发明专利(申请号：CN201510477116.9)，还获得了国家新兽药注册证书(证书号：2015新兽药证字67号)，该试剂盒的成功开发和广