乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110904151A(43)申请公布日2020.03.24(21)申请号201911045012.5C07K14/575(2006.01)(22)申请日2019.10.30C12N15/11(2006.01)(71)申请人广西大学地址530003广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号(72)发明人刘庆友黄孔威李志鹏崔奎青石德顺刘福航赵海潞张晓溪(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(普通合伙)11491代理人王峰刚(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/66(2006.01)A01K67/027(2006.01)C12Q1/6888(2018.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图8页(54)发明名称乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用(57)摘要本发明提供乳腺特异性表达人Amylin基因载体，还提供乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物及其应用。本发明利用β-酪蛋白启动子启动人Amylin基因，构建了乳腺特异性表达人Amylin基因载体，并将该载体转入动物基因组中获得乳腺特异性表达人Amylin蛋白的转基因动物，其乳汁特异性表达人Amylin蛋白，且人Amylin基因在动物乳腺中的表达并未对动物的正常生理活动造成不良影响。因此，应用本发明可望通过转人Amylin小鼠、奶山羊或奶水牛的制备，获得大量廉价的人Amylin蛋白，并分离提纯生产药用人源Amylin，产生巨大的经济效益和社会效益。CN110904151ACN110904151A权利要求书1/1页1.乳腺特异性表达人Amylin基因载体，其特征在于：所述载体的构建方法为：首先获得人Amylin基因序列，然后将其密码子优化为哺乳动物偏好性密码子，并在其两端加入XhoI酶切位点，利用XhoI酶，酶切pBC1载体，分别构建pBC1-Amylin和pBC1-amylin的双荧光报告载体。2.权利要求1所述的乳腺特异性表达人Amylin基因载体在生产乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物中的应用。3.乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物，其特征在于：将权利要求1所述的载体用SalI酶与NotI酶切回收，通过原核显微注射的方法，在雌雄原核融合期将酶切后的载体注入小鼠的受精卵，将注射后的受精卵移植入同期发情的代孕母鼠的输卵管处，制备乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物。4.根据权利要求3所述的乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物，其特征在于：所述转基因动物为转基因小鼠、山羊或水牛。5.根据权利要求4所述的乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物，其特征在于：所述转基因小鼠为转人Amylin基因FVB鼠。6.权利要求3-5任一项所述的乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物在生产人Amylin蛋白中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：是对产仔的转基因动物进行采奶得到的。8.一种人Amylin蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：(1)构建乳腺特异性表达人Amylin基因载体；(2)应用步骤(1)所述载体生产乳腺特异性表达人Amylin基因转基因动物；(3)对产仔的步骤(2)中的转基因动物进行采奶，得到含有人Amylin蛋白的乳汁。9.用于检测转基因动物中人Amylin表达的引物和探针，其特征在于：所述引物为：F:5′-ATGAAGGTGCTGATCCTGGCC-3′R:5′-AGTAGGTGTTGCTGCCCACG-3′；所述探针为：5′-CCTGGTGGCCCTGGCCATCGC-3′。2CN110904151A说明书1/5页乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及乳腺特异性表达人Amylin基因载体、转基因动物的构建方法及应用。背景技术[0002]胰淀素(Amylin/IAPP)是胰岛β细胞分泌的一种多肽类激素，由37个氨基酸构成，分子量为3.85KD。它和胰岛素一起表达、合成、分泌，被认为是胰岛素的孪生兄弟，以旁分泌方式负性调节胰岛素的分泌。目前认为，胰淀素作为胰岛第3种重要的活性激素，与胰岛素协同调节体内血糖平衡。正常情况下，胰淀素和胰岛素共同存在于胰岛β细胞中，在生理量的葡萄糖刺激下二者以1:20～100的比例同步分泌，共同维持血糖稳定。HinshawL.等研究表明胰淀素通过抑制胰高血糖素，参与餐后的血糖调控，并且胰淀素在中枢也存在相应的受体，可以刺激中枢产生饱腹感以及延缓胃排空。因此对于糖尿病患者降血糖，尤其是发生胰岛素抵抗的二型糖尿病病患可以使用胰淀素，在降低胰岛素使用量的同时达到更好的降糖效果。[