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流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)

本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘

化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，

二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两

大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)

一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细

胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入TritonX-100，以

增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以

降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。由于要鉴定

DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。

由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。

另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活

细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。AnnexinV/PI

凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋

亡细胞区分开来。它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般

2.5ug/mL。

所需试剂：

1、PI染液：

用于检测细胞周期的PI配制如下：

方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：

5mg-----PI

0.1ml---TritonX-100
3.7mg--EDTA

10ml----PBS

2、RNaseA——2mg

方法二,直接配制PI工作液：

PI-----5mg

RNaseA——2mg

1.0%TritionX-100——0.25ml

枸椽酸钠——100mg

生理盐水——65ml

调pH值至7.2-7.5

加蒸馏水至100ml,棕色瓶分装，保存在4℃

操作步骤

1.细胞培养

铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5cells/well,如果要

加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。流式侧细胞周期

对细胞的种板密度非常讲究，如果密度过高就会出现接触抑制，所以

建议刚开始做预试验时可以种个细胞密度梯度。

2细胞收集，细胞培养至一定时间后，如果是贴壁培养的细胞，常规

胰酶消化，PBS洗2-3次，制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1－

5*106cells/ml。

3.细胞固定

3.1.加入3ml预冷PBS重悬细胞，800rpm×5min，吸净上清。
3.2.加入500ulPBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预

冷的100%乙醇（-20℃）1.5ml，使其终浓度为75%，-20℃放置过

夜固定，最长可以放置1周左右。

注意：固定细胞时，确保PBS悬浮细胞为单个，加入无水乙醇的时候

要慢速，保证逐滴。细胞保存在4℃也可以。

4.细胞标记

4.1.取出固定的样品，800rpm×5min，弃上清。

4.2.加入3ml预冷PBS重悬细胞，800rpm×5min，离心收细胞。

注意：可重复1-2次，以除去乙醇

4.3.加入150ulRNaseA（250-500ug/mlPBS稀释）重悬细胞，37℃消

化30分钟。

注意：做细胞周期时，RNaseA加与否对结果影响不大；如果要同时

测凋亡，尽量加入RNaseA。另外，在做这步之前，可用200目滤网

过滤

4.4.加入150ulPI工作液，4℃避光染色30分钟。

注意：如果用方法二配制的直接PI工作液，其已含有RNaseA，因此

4.3步应省略。PI染液的量可根据细胞的多少来加，比如说有的人喜

欢加500ul或1ml，其实只要和细胞完全孵育就可以，量多量少对结

果不会影响太大。

4.5.转至流式检测管，上机检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由

630带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞，采用

设门技术排除粘连细胞和在碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期
的百分率和凋亡细胞百分率。

5、细胞周期分析：

正常人静止体细胞有46条染色体，为二倍体细胞，而正常增殖细胞

则存在不同的DNA含量。在细胞周期的各个时期（G0（暂时离开细

胞周期,停止细胞分裂,去执行一定生物学功能的细胞所处的时期）、G1、

S、G2、M）中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，在G1期细胞

开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体，进入S期后开

始合成DNA，此时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间。当DNA

复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质，直到进入

M期，因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期，一旦有丝分裂

分裂成2个细胞，同