流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用.ppt

流式细胞术FlowCytometry什么是流式细胞仪1.发展历史1934Moldavan1973Steinkamp2.定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术.3.特点测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞可进行多参数测量在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。二、流式细胞仪的工作原理和基本结构基本结构三、流式细胞仪可检测到的细胞参数血液涂片外周全血细胞散射光双参数点图荧光信号荧光信号与细胞特性二色镜123三数据处理及流式报告流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。GeoMean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。散点图图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞五、流式细胞术的应用一）细胞DNA含量检测单参数直方图DNA细胞周期分析2倍体含量与凋亡关系二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究1.肿瘤诊断2倍体2.凋亡研究AnnexinVAssay图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48根据凋亡细胞的特点来检测CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。流式细胞术检测细胞表型流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。五）细胞内蛋白的分析：荧光信号荧光样本制备端粒（荧光蛋白）六）细胞内钙离子测定1×106/ml的细胞悬液，加入终浓度为1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60分钟。以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。FCM检测胞内钙离子、膜电位和线粒体功能M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即：所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。六.分选：488nmlaser对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜流式细胞仪谢谢大家