细菌的生理生化鉴定方法.pdf

方法

2.3.5细菌的生理生化鉴定
１、形态学观察
采用插片法、埋片法,对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏
染色进行油镜观察。
①革兰氏染色
溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番
红复染液等。
试验步骤：(1)涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干
燥和固定。

(2)初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出
水无色。

(3)媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，
水洗至流出水无色。

(4)脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出
液无色时立即用水洗去乙醇。

(5)复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，
用吸水纸吸去残水晾干。
(6)镜检：用油镜观察。
②芽孢染色
(1)制片：按常规方法涂片、干燥及固定。
(2)加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹

住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切
勿让涂片干涸。
脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。

(3)复染：用0.5%番红水溶液复染2min。
(4)水洗：用缓流自来水冲洗至无色。
(5)镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色（硝酸银染色法）
(1)载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后
用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可
能残留的油迹。

(2)菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌
悬液，不能剧烈震荡。
(3)制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，
用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。

(4)染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴
加B液染色约1min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水
冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
(5)镜检：用油镜镜检观察。

A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用）：
A：单宁酸5ｇ，三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15%
甲醛2mL。
B：硝酸银粉末2ｇ，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL
溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴
至出现薄雾。
２、糖类分解试验

配方：蛋白胨1.0ｇ；NaCl0.5ｇ；0.2%溴百里香酚兰1.2mL；葡萄糖1.0
ｇ；蒸馏水100mL。
基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利
用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二

氧化碳等）。当发酵产酸是，指示剂可有紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气
体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤：用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的
编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行，
可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡。

再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培养2～3d。观察颜色变化及小试管
中有无气泡。
３、V-P试验

配方：蛋白胨1.5g；葡萄糖1.5g；K2HPO41.5g；蒸馏水300mL；pH：7.4
基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。某些细菌能分解葡
萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境再被空
气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称

V-P反应。
试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d后，于培养物中加入
1mL10％的NaOH，混匀，再加入3～4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基
表面的下层出现红色者，为阳性。
４、甲基红试验

配方：与V-P试验的配方相同
基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还

可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH将至4.5以下，当加入
甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产
生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度

仍会在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。
试验步骤：接种细菌于培养基，在37℃培养2～7d后，于培养物中加入几
滴甲基红酒精溶液（0.1ｇ甲基经溶于300mL95%乙醇中，加蒸馏水至500mL），
如呈红色，表示阳性。
５、柠檬酸盐利用试验

配方：柠檬酸钠1ｇ；硫酸镁0.2ｇ；NaCl5ｇ；NH4H2PO41ｇ；K2HPO4
1ｇ；琼