一种快速建立大泷六线鱼近交系的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111096301A(43)申请公布日2020.05.05(21)申请号202010005224.7(22)申请日2020.01.03(71)申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市市南区南海路7号(72)发明人吴志昊尤锋宋宗诚王丽娟谭训刚王凌(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人李颖(51)Int.Cl.A01K67/027(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种快速建立大泷六线鱼近交系的方法(57)摘要本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种高效快速建立大泷六线鱼近交系的方法。收集大泷六线鱼精液灭活，利用遗传灭活的精子与分离成单粒的卵进行人工授精，再通过静水压力抑制第二极体排放，而后诱导雌核发育获得大泷六线鱼近交系。采用本发明方法可高效、稳定、可靠地诱导获得100％的大泷六线鱼雌核发育鱼苗，快速建立近交系。CN111096301ACN111096301A权利要求书1/1页1.一种快速建立大泷六线鱼近交系的方法，其特征在于：收集大泷六线鱼精液灭活，利用遗传灭活的精子与分离成单粒的卵进行人工授精，再通过静水压力抑制第二极体排放，而后诱导雌核发育获得大泷六线鱼近交系。2.按权利要求1所述的快速建立大泷六线鱼近交系的方法，其特征在于：1)人工授精向采集的卵中加入等体积Ringer氏液进行洗卵至获得单粒的卵；取灭活的精液与卵在避光条件下按体积比1:1-2比例充分混合，慢慢喷淋等体积海水，至卵开始互相粘附时将卵聚成1-2层的薄片，继续加入海水至受精卵卵片完全硬化后用新鲜海水冲洗，而后进行流水充气孵育；2)染色体诱导加倍受精后15-25min，将受精卵在55-70MPa静水压下进行休克处理，处理4-7min，而后继续流水充气孵育；3)受精卵的孵育在受精卵孵育期间，自5dpf(受精后第5天)开始，每1-2d，对孵育的受精卵进行清理，12-14℃条件下大泷六线鱼约22-26d破膜孵化，获得大泷六线鱼近交系。3.按权利要求1或2所述的快速建立大泷六线鱼近交系的方法，其特征在于：所述灭活的精液为取精液用预冷的Ringer氏液稀释100-200倍，用剂量为45,000-50,000erg/mm2的紫外线将精子在0-4℃下灭活，灭活后的精液避光放在冰上暂存。4.按权利要求2所述的快速建立大泷六线鱼近交系的方法，其特征在于：所述步骤1)中鱼卵受精前用Ringer氏液将卵中带的粘液洗去，而后通过过滤得到分离成单粒的卵，再采用半干法进行人工授精。5.按权利要求2所述的快速建立大泷六线鱼近交系的方法，其特征在于：所述步骤1)中，受精时刻为将紫外灭活的精液与分离的卵充分混合后喷淋海水时。6.按权利要求2所述的大泷六线鱼雌核发育诱导方法，其特征在于：所述步骤3)在受精卵孵育期间，自5dpf(受精后第5天)开始，每1-2d，用1-2ppm的抗生素对受精卵卵片消毒10-20min，同时清理掉卵片表面的杂质及死卵，随后用清洁海水冲洗，继续流水充气孵育；且孵化期间避免强光直射。2CN111096301A说明书1/5页一种快速建立大泷六线鱼近交系的方法技术领域[0001]本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种高效快速建立大泷六线鱼近交系的方法。背景技术[0002]大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)，属鲉形目(Scorpaeniformes)、六线鱼科(Hexagrammidae)，为冷温性鱼类，是我国北方及日韩重要的海水增养殖鱼类。遗传育种是规避其目前累代养殖模式带来的种质退化风险的有效途径，亟待开展。常规选择育种周期长，而雌核发育技术则可以快速获得近交系，极大缩短了育种周期，因此进行大泷六线鱼的雌核发育技术的开发具有十分重要的产业价值。[0003]雌核发育技术目前已在多种鱼类中得到开发利用，但大泷六线鱼具有特殊的精卵特征，常用的雌核发育方法不适用。大多数鱼类成熟精子处于静止状态，排出体外后在环境条件下被激活。而大泷六线鱼精子浓度较高，精液取出后不需激活便已处于高活力状态。由于雌核发育首先需要灭活精子，这一过程一般需要5-10min，甚至20min以上。对大泷六线鱼而言，若不抑制精子运动，多数精子在紫外灭活后随能量消耗活力下降，会显著影响授精效果。因此相较其它鱼类，大泷六线鱼的精子灭活需要考虑不同的方法和条件。大泷六线鱼的卵也与多数养殖鱼类不同，为粘性卵，卵粒间有大量蛋清样粘液存在，在接触海水后会迅速硬化成具弹性的卵块。目前已有报道的鲤、鲫、黑尾近红鲌等淡水鱼类以及红鳍东方鲀等海水鱼类虽然也属粘性卵，但仅卵膜具有粘性，并无粘液存在，采用常见的半干法授精，结合脱粘或将卵附着在网片上的步骤便可避免卵粘结成块。而大