鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记及其制备方法和其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102061334A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102061334A(43)申请公布日2011.05.18(21)申请号201010106459.1(22)申请日2010.02.05(71)申请人南京中医药大学地址210029江苏省南京市汉中路282号(72)发明人谷巍巢建国吴启南张莹郭戎邓海山支兴蕾(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人肖明芳(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表4页附图2页(54)发明名称鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记及其制备方法和其应用(57)摘要本发明公开了一种鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记及其制备方法和其应用。本发明通过随机扩增多态性DNA方法筛选道地茅苍术中特异的DNA分子片段，再经回收、克隆及测序得到特异引物，将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记，即：SCAR651和SCAR1030，此二分子标记检测的可靠性、专一性及重复性均佳，可作为道地和非道地茅苍术鉴定的分子标记，为野生茅苍术资源的有效保护及这一优良种质资源的可持续利用提供了科学依据。CN102634ACCNN110206133402061340A权利要求书1/2页1.鉴别道地药材茅苍术的DNA分子标记，其特征在于，所述的分子标记SCAR651和SCAR1030是采用RAPD分子标记方法筛选出随机引物S1127和S45，再根据随机引物S1127和S45扩增出的特异DNA片段设计合成SCAR引物，然后转换成稳定的SCAR651和SCAR1030分子标记，该标记是采用下述方法制备得到的：(1)取江苏句容茅山产的道地药材茅苍术，采用CTAB法提取茅苍术的DNA；(2)采用RAPD分子标记方法筛选出能在道地茅苍术中出现特异性条带的随机引物S1127和S45；(3)对引物S1127和S45扩增出的特异DNA片段进行克隆、测序，根据测序结果设计合成SCAR引物，再转换成稳定的SCAR651和SCAR1030分子标记。2.根据权利要求1所述的鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记，其特征在于，所述的采用RAPD分子标记方法筛选出能在茅苍术中出现特异性条带的随机引物S1127和S45，具体步骤为：采用100条10bp的寡核苷酸为随机引物对道地茅苍术基因组DNA进行PCR扩增，RAPD-PCR反应使用30μl体系，其中包括：1.2μL25mMMgCl2，0.6μL10mMdNTP，1μL20μM随机引物，3μL10×Buffer，3UTag酶，10ng茅苍术模板DNA，加双蒸水至30μL，PCR反应在Bio-RadMyCyclerPCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒，36℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，40个循环；72℃10分钟，4℃中保存，每个反应重复3次以确定所得条带的可重复性，扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，Gelred染色，GelDocXR+凝胶成像系统记录结果。3.根据权利要求2所述的鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记，其特征在于，所述的采用RAPD分子标记方法筛选出能在茅苍术中出现特异性条带的随机引物S1127和S45，它们序列如下：S1127：TCGCTGCGGA；S45：TGAGCGGACA4.根据权利要求1所述的鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记，其特征在于，步骤(3)中根据引物S1127和S45扩增出的特异DNA的测序结果设计合成四条SCAR引物，分别命名为SCAR45F、SCAR45R、SCAR1127F和SCAR1127R，其中SCAR45F和SCAR45R为一对，SCAR1127F和SCAR1127R为一对，它们序列分别为：SCAR45F：TGAGCGGACAAACACAAACAGCAAGSCAR45R：TGAGCGGACAGCGAGTTGGAGGACGSCAR1127F：TCGCTGCGGAGCGGGGGATAAAGGASCAR1127R：TCGCTGCGGAGGTAGCTAAATTACC。5.根据权利要求1所述的鉴别道地药材茅苍术的特异DNA分子标记，其特征在于，步骤(3)中根据设计合成的SCAR引物，再转换成稳定的SCAR651和SCAR1030分子标记，具体步骤为：取道地茅苍术30株，以其基因组DNA为模板进行PCR扩增，SCAR-PCR扩增体系为：0.6μL10mMdNTP，1μL20μMSCAR引物，3μL10×Buffer，3UTag酶，10ng茅苍术模板DNA，加双蒸水至30μL，反应程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒，55℃退火1分钟，