一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107041363A(43)申请公布日2017.08.15(21)申请号201710387339.5(22)申请日2017.05.27(71)申请人塔里木大学地址843300新疆维吾尔自治区阿拉尔市塔里木大道东1486号(72)发明人王惠娥焦海红汪澜张强支松贾珊珊芮雪(74)专利代理机构北京华仲龙腾专利代理事务所(普通合伙)11548代理人李静(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书2页说明书4页附图3页(54)发明名称一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法(57)摘要本发明公开了一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，该方法的具体步骤如下:1)、提取绵羊新鲜精液；2)、将集精杯放在保温桶，运回至实验室；4)、配制四种稀释液；5)、将稀释液放在37℃水浴锅中；6)、对鲜精进行稀释；7)、对步骤6)中稀释精液I、II、III、IV进行保存，将离心管盖盖紧后放在泡沫的离心管架，室温放置保存；8)、对稀释精液中的精子活率进行测定；10)、对稀释精液中的精子质膜完整率进行检测。该绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，通过提取成活率较高精液，降低精子存活率低对实验结果的影响，通过四组不同配比的稀释液分别对绵羊精子的活率，测得稀释液Ⅲ的稀释液配比更加有利于精子的存活。CN107041363ACN107041363A权利要求书1/2页1.一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：包括以下步骤：1)、提取绵羊的新鲜精液，并将提取的新鲜精液放进集精杯中；2)、将步骤1)中盛有精液的集精杯放在保温桶水浴，并将提取的精液运回至实验室，运输过程中防止保温桶剧烈震荡；3)、准备制作稀释液的原材料，Tris、柠檬酸、乳糖、花青素、VC、青霉素和链霉素；4)、采用步骤1)中的原材料分别配制以下四种稀释液，其中稀释液I的配方为Tris1.92g，柠檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液II的配方为Tris2.64g，柠檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液III的配方为Tris3.00g，柠檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液III的配方为Tris3.00g，柠檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g，稀释液IV的配方为Tris3.53g，柠檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；5)、将步骤4)制作的稀释液放在37℃水浴锅中，使稀释液的温度升温到37℃，并使鲜精温度和稀释液温度一致，达到温度的平衡；6)、对步骤2)中的鲜精进行稀释，取0.4mL鲜精加入到塑料离心管中，然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液I，得到稀释精液I，之后再取0.4mL鲜精加入到另一只新的塑料离心管中，然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液II，得到稀释精液II，依次制作稀释精液III与稀释精液IV；7)、对步骤6)中稀释精液I、II、III、IV进行保存，将离心管盖盖紧后放在泡沫的离心管架，室温放置保存；8)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子活率进行测定，先将分层的精液用移液枪轻轻吹打混匀，静止5min后，吸取10μL稀释精液I滴在37℃的载玻片上，盖上盖玻片，置400×光学显微镜下进行观察确定，至少观察5个不同视野，每个视野观察20个精子，记录存活精子数，算出精子活率，运动的精子占精子总数的比例即为精子活力，精子中呈直线运动的精子数占精子总数的百分比即为精子活率，然后依次对稀释精液II、III、IV的精子活率进行测定；9)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子顶体完整率进行检查，取5μL稀释精液I滴在37℃的载玻片然后加入5μLPBS液稀释，将精子密度调整为每毫升1×106个，在载玻片上涂片，采用烘片机烘干，然后滴加6.8％重铬酸钾固定30min，用自来水流水冲洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆萨染色混合液染色1.5h，再次用自来水流水冲洗染液，自然晾干，放在400×显微镜下观察200个精子，计数顶体完整的精子数量，计算出顶体完整率，然后依次计算出稀释精液II、III、IV中的精子顶体完整率；10)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子质膜完整率进行检测，取10μL稀释精液I用PBS液稀释，将精子密度调整为每毫升1×106个，孵育后取10μL调整后的悬液滴于血细胞计数板，在400×光学显微镜下观察，计算弯尾占总精子数的百分率，