基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103388025A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103388025103388025A(43)申请公布日2013.11.13(21)申请号201310288791.8(22)申请日2013.07.10(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人罗美中潘永龙(74)专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司42104代理人王和平(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书35页说明书35页附图6页附图6页(54)发明名称基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法(57)摘要本发明公开了一种基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法。该方法首先构建BAC文库并构建BAC克隆DNA混合池，再对混合池DNA进行高能量测序；解析出克隆的特征序列集合与k-mer集合，利用克隆的特征序列构建出克隆重叠群，利用克隆重叠群上将克隆k-mer集合分割成小的k-mer集合，将混合池的NGS序列组装后的序列定位到克隆重叠群上；根据组装后序列与混合池的NGS序列双末端比对结果连接定位后的序列，并确定它们的方向；最后利用分子标记确定克隆重叠群的相对位置与方向，将克隆重叠群的序列连接成整条染色体序列，得到全基因组序列。本发明利用NGS高通量测序技术与克隆DNA混合池，不仅构建出全基因组的物理图谱，同时将拼装后的序列定位到物理图谱上，实现两者的整合。CN103388025ACN103825ACN103388025A权利要求书1/2页1.基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法，其特征在于：包括以下步骤：1）提取全基因组DNA，构建BAC文库；2）构建BAC克隆混合池；3）提取BAC克隆混合池的DNA；4）对步骤3）中的BAC克隆混合池的DNA利用NGS进行双末端测序；5）扫描各个混合池的序列，获得各个混合池的特征序列集合与k-mer集合；6）根据混合池的特征序列集合与k-mer集合，解析出各个克隆的特征序列集合与k-mer集合；7）利用克隆的特征序列集合构建克隆重叠群；8）利用克隆重叠群将克隆的k-mer集合分割成小的k-mer集合并定位到克隆重叠群上；9）对步骤4）中混合池的NGS序列进行拼装得到序列重叠群；10）将序列重叠群定位到克隆重叠群上，并利用测序的双末端信息连接序列重叠群，确定它们的方向，得到克隆重叠群的序列；11）利用分子标记确定克隆重叠群的相对位置与方向，将克隆重叠群的序列连接成整条染色体序列，得到全基因组序列；其中，关于克隆特征序列集合与k-mer集合的解析的总算法如下：某一物种BAC文库的克隆总数为a，构建的混合池总数为x，则；第κ维，索引为λ混合池的k-mer集合表示为：P(κ,λ)；包含某一给定克隆的混合池的k-mer集合为：{P(δ)|δ<m,P(δ)∈P}；包含同一克隆的混合池的k-mer集合的交集，即克隆的IKS为：某一克隆在混合池中的排除并集EUKS为：；某一克隆k-mer集合的所有排除并集的交集为：；某一克隆的最终k-mer集合FKS为：CF=Cx-CIx。2.根据权利要求1所述的基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法，其特征在于：所述序列重叠群定位与整合算法如下：1）克隆重叠群的分割根据克隆重叠群中克隆的相对位置，将克隆的k-mer集合分割成更小的区块，假设有两个克隆属于同一个重叠群并相互重叠，其中集合A为其中一个克隆的k-mer集合，集合B为另一个克隆的k-mer集合，那么这两个克隆的k-mer集合可以分解成3个子集，即共有的k-mer集合(A∩B)，A特有的k-mer集合(A-B)和B特有的k-mer集合(B-A)。两者共有的k-mer集合位于它们特有的k-mer集合之间，这样三个k-mer的相对位置就确定了，根据这一算法，对每一个克隆重叠群的所有的克隆，按照它们相对位置，从一端开始逐一分割，从而将一个克隆重叠群中所有克隆的k-mer集合分割成小的子集，并且这些子集的相对位置是确定；2）序列定位与整合对各个混合池的NGS序列利用短序列拼装软件如velvet分别进行拼装，再将拼装结果2CN103388025A权利要求书2/2页合并，利用长序列拼装软件如PCAP进行进一步拼装，得到序列重叠群，然后将每一个序列重叠群分解成k-mer集合，与上一步得到的所有小区块的k-mer集合求交集，找出其中交集元素总数最多的区块，这样就将序列重叠群定位到了克隆重叠区的小区块上，如果定位到的同一个克隆重叠群的序列包含有相互重叠的部分，则需要分别再次拼装合并相互重叠的序列，然后再次定位合并后的序列。3CN103388025A说明书1/35页基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法技术领域[0