表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106085971A(43)申请公布日2016.11.09(21)申请号201610428715.6A61K39/295(2006.01)(22)申请日2016.06.15A61K39/23(2006.01)A61K39/17(2006.01)(83)生物保藏信息A61P31/20(2006.01)CCTCCNO:V2016272016.04.19A61P31/14(2006.01)(71)申请人湖北省农业科学院畜牧兽医研究所地址430064湖北省武汉市洪山区南湖瑶苑1号(72)发明人邵华斌温国元罗青平罗玲王红琳张腾飞汪宏才张蓉蓉卢琴艾地云(74)专利代理机构北京金智普华知识产权代理有限公司11401代理人杨采良(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书4页C12N7/01(2006.01)序列表3页附图1页(54)发明名称表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法(57)摘要本发明公开了一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:V201627。该疫苗株在感染动物或细胞后，可高效表达鸡细小病毒的VP2蛋白。该毒株可用于制备鸡新城疫、细小病毒二联耐热活疫苗。CN106085971ACN106085971A权利要求书1/1页1.表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:V201627。2.表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.1鸡细小病毒VP2基因的PCR扩增PCR扩增鸡细小病毒的VP2基因，扩增引物为：上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGAACCAG-3′，下游引物5′-ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGGGAGCC-3′，对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3′，下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-3′，扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C，对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接；1.3重组质粒pTS-VP2/CPV的克隆连接采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的VP2基因片段和耐热载体片段进行克隆连接，连接序列为GCCATGGGTAACTTT和ATGGTGAGCAAGGGC，连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，对菌液进行VP2基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液进行质粒提取；1.4重组病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢复采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-VP2/CPV与三个分别表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞,转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株。3.权利要求1所述的表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备重组病毒中的应用。4.权利要求1所述的表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备鸡细小病毒、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。2CN106085971A说明书1/4页表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。背景技术[0002]细小病毒对家禽，特别是鸭、鹅等水禽危害较大。鹅细小病毒感染，俗称鹅流感、小鹅瘟，是一种侵害幼鹅和番鸭的高度接触传染性疾病，表现为急性、亚急性和慢性型，急性型可引起10日龄内的雏鹅100％死亡。在大规模饲养鹅和番鸭的国家，该病具有重要的经济意义。种鹅免疫接种可打打降低本病的影响。灭活疫苗或致弱活疫苗可诱导产生良好的免疫反应，目前已有鹅细小病毒和番鸭细小病毒二价疫苗。但是未见有鸡细小病毒疫苗的研究报道。[0003]随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫