科研医学思路和方法作业.pdf

.~从MHCⅠ/Ⅱ类相关因子探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用学号：12007076姓名：李建伟专业：中医外科学(一)研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题1.研究内容课题以VZV免疫逃避机制中发挥着重要作用的感染病毒细胞免疫识别的MHCⅠ/Ⅱ类基因抑制为切入点，围绕IFN-γ和参与免疫逃避的的两条主要途径，有目的地观察IFN-γ和相关基因CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律，进一步检测CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA的表达变化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性的动态变化，并对上述指标的相关性及变化规律进行分析，说明调节VZV病毒感染的免疫逃避机制是针灸治疗带状疱疹、减轻疼痛和后遗症的关键。且明确针刺与放血作用机制的差异所在。主要开展以下工作：研究内容：（1）皮损组织病理学观察。（2）镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。（3）流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。（4）免疫组化法ABC染色法检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。（5）westernblot检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。（6）RT-PCR法检测：皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA、MHCⅡmRNA。2.研究目标：2.2.1旨在明确针灸治疗带状疱疹，减轻疼痛和后遗神经痛，与调节MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的分布及表达关系，为针灸治疗免疫逃避类疾病提供科学依据。2.2.2通过比较针灸与传统抗病毒药物的作用差异，为解决带状疱疹病毒耐药性问题提供理论依据。2.2.3旨在明确针刺与放血在治疗疱疹作用机制中的差异。.~3.拟解决的关键性问题：针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的调节与其有效干预VZV病毒免疫逃避机制的关系。(二)拟采用的方案及可行性分析1.拟采用的方案实验环境：实验室相对封闭，自然采光，环境温度控制在20℃～25℃之间，湿度控制在60%左右。实验动物：清洁级昆明种小鼠，体重22～24g，笼养，自由饮食，由上海市实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。1.1分组及造模：第一次实验采用大鼠192只，按照体重分层随机，分为6组，每组8只，在造模完成后开始治疗，连续7天，隔日（第1、3、5、7天）处死一批，动态观察针刺放血对大鼠VZV病毒初感染的影响；第二次实验在造模后30天开始治疗，观察针刺放血对大鼠VZV病毒潜伏、复发的影响，其他处理同上，第7天处死取材观察；造模：腹腔注射VZV8805株系病毒，按照100TCID50/0.1ml病毒量接种细胞，感染后48小时，模型即成。模型组：造模方法同上，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。药物组：造模方法同上。左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d，连续三天，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。针刺组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，在造模完成后，开始针刺，进针0.2～0.3mm，平补平泻，留针10min，每日1次，连续7天。放血组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，使用皮肤针沿皮损和脊神经叩刺，连续7天。针刺加放血组：方法同针刺组和放血组，治疗连续7天。正常组：腹腔注射同体积生理盐水。每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定，连续7天。1.2取材方法：.~造模结束后，在模型组40只中随机处死8只，取材检测VZV对对小鼠相关指标的影响。针刺组、放血组、针刺加放血组、药物组、正常组在治疗后的第1、3、5、7天随机处死8只小鼠取材。取材放入-80oC低温冰箱保存、备检。1.3穴位选取：固定小鼠方法：根据小鼠的形体，在木板上钉上四个适当距离的铁钉，将夹子套在铁钉上，用夹子夹住小鼠的四肢以做固定。小鼠穴位定位参考《实验针灸学》，模拟小鼠的定位方法：“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间；“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间，左右侧各一穴；“合谷”在在手背，当第二掌骨桡侧的中点处，“曲池”在在肘横纹外侧端，当尺泽与肱骨外上髁连线中点，“委中”在在腘横纹中点，当股二头肌腱与半腱肌腱的中间，“尺泽”在在肘横纹中，肱二头肌腱桡侧凹陷处。1.4观察指标及方法：1.4.1皮肤组织病理切片1.4.2镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数各组小鼠每天定时，专人割尾静脉采血10μl，加入0.38ml的白细胞稀释液中，摇匀，静置3分钟，光镜查外周血有核细胞、白细胞数和淋巴细胞、巨噬细胞分类计数；1.4.3流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。①制备样品：处死动物，