一种褐藻胶裂解酶基因及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107099545A(43)申请公布日2017.08.29(21)申请号201710464114.5(22)申请日2017.06.19(71)申请人五洲丰农业科技有限公司地址264002山东省烟台市芝罘科技工业园华盛路20号(72)发明人王学江李峰张志凯迟艳(74)专利代理机构烟台双联专利事务所(普通合伙)37225代理人梁翠荣(51)Int.Cl.C12N15/60(2006.01)C12N9/88(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页(54)发明名称一种褐藻胶裂解酶基因及其应用(57)摘要本发明公开了一种褐藻胶裂解酶基因及其应用。本发明还公开利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达来制备的褐藻胶裂解酶AlgNJU-03，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。本发明提供的褐藻胶裂解酶AlgL可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。CN107099545ACN107099545A权利要求书1/1页1.一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其特征在于，该菌株中导入了褐藻胶裂解酶基因，所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求3所述的产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将褐藻胶裂解酶基因克隆到质粒中，得到重组载体；(2)将重组载体转化宿主菌，得到产褐藻胶裂解酶的基因工程菌。5.根据权利要求4所述产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的质粒为pET21a（+）。6.根据权利要求4所述产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌DH5α。7.权利要求1所述褐藻胶裂解酶在裂解褐藻酸盐和褐藻多糖中的应用。8.权利要求3所述产褐藻胶裂解酶的基因工程菌在发酵产褐藻胶裂解酶中的应用。2CN107099545A说明书1/6页一种褐藻胶裂解酶基因及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株褐藻胶裂解酶基因及其应用。背景技术[0002]我国拥有广阔的海域面积，其中蕴含着丰富的海洋生物资源，尤其是海藻资源。褐藻主要包括海带、裙带等，其细胞壁中富含的褐藻胶是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶的主要存在状态为水溶性的褐藻酸钠(sodiumalginate)、褐藻酸钾等褐藻酸盐类和水不溶性的褐藻酸(alginicacid)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(刘航,天然产物研究与开发,2012,24:201-204)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(WongTYetal.AnnualReviewofMicrobiology,2000,54:289-340)。[0003]褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。DongEunKim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomycessp.ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在EscherichiacoliBL21(DE3)