转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107099547A(43)申请公布日2017.08.29(21)申请号201710318093.6(22)申请日2017.05.08(71)申请人北京交通大学地址100044北京市海淀区上园村3号(72)发明人晏琼陈友明(74)专利代理机构北京正理专利代理有限公司11257代理人赵晓丹(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12Q1/68(2006.01)A01H5/00(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图6页(54)发明名称转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法(57)摘要本发明公开一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，通过构建植物过表达载体将gshB基因转入发根农杆菌A4获得转gshB基因侵染菌液，然后转gshB基因侵染菌液与龙葵外植体共培养，诱导出含有gshB基因的龙葵毛状根，对获得的转gshB基因龙葵毛状根扩大培养，并进行分子鉴定和荧光检测。本发明进一步对获得的转gshB基因龙葵毛状根的Cd富集含量测定表明所能富集的Cd的含量最高可达野生龙葵植株的2倍。本发明不仅可以解决龙葵植株栽培周期长、受气候及地理条件制约等问题，并且可高效大量地富集重金属Cd，为利用龙葵毛状根富集重金属Cd提供材料支撑，具有广阔的开发和应用前景。CN107099547ACN107099547A权利要求书1/1页1.一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备龙葵外植体；(2)制备转gshB基因侵染菌液：将gshB基因与真核表达载体PBI121-gfp连接，将连接产物用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；涂平板，挑取阳性克隆，转入含有卡那抗性的YMA液体培养基扩增培养，得到转gshB基因侵染菌液；(3)共培养诱导转gshB基因龙葵毛状根：将转gshB基因侵染菌液与龙葵外植体进行共培养；(4)除菌培养：将共培养后的龙葵外植体转移到已湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养2d，随后转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基上进行除菌培养，一周后转到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基上，一个月后龙葵外植体愈伤处会长出的细长毛状根；(5)毛状根液体培养基的扩大培养：将毛状根转入MS液体培养基中，扩大培养；(6)转gshB基因龙葵毛状根的检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述扩增培养是在28℃，150-200rpm摇床中扩增至OD600＝0.6。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)所述转gshB基因龙葵毛状根的检测可以采用分子鉴定和荧光检测的方法。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述分子鉴定是通过提取毛状根的DNA，PCR法检测农杆菌Ri质粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判断是否成功获得转gshB基因毛状根；所述荧光检测是通过绿色荧光蛋白检测，验证是否成功获得转gshB基因毛状根。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述荧光检测的荧光显微镜的参数是波长487nm、曝光时间583ms。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述龙葵外植体是通过取龙葵种子灭菌后接种于MS固体培养基，28℃光照培养，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片获得。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述扩大培养为28℃，100-110rpm摇床进行培养。2CN107099547A说明书1/5页转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法技术领域[0001]本发明涉及植物生物技术领域。更具体地，涉及一种转gshB基因提高龙葵毛状根镉富集的方法。背景技术[0002]龙葵是茄属茄科一年生草本植物，几乎全中国都有分布，广泛分布于亚、欧、美洲的温带至热带地区。目前，世界范围内已经发现的重金属超富集植物有400多种，在已发现的超富集植物中，Cd超富集植物总体上很少，目前仅报道遏蓝菜(ThlaspiarvenseL)、宝山堇菜(Violabaoshanensis)、油菜(BrassicacampestrisL.)、东南景天(Sedumalfredii)、龙葵(SolanumnigrumL.)、商陆(PhytolaccaacinosaRoxb)、红菾菜(Betavulgarisvar.cicla)等Cd超富集植物。在这些植物中，遏蓝菜是研究最多的，但遏蓝菜对Cd的富集不具备特异性。龙葵因其分布广泛、生命力强、对Cd的富集更专一等优势得到越来越多的关注。[0003]随着工农业的迅速发展和城市人口的剧增，环境污染问题与日剧增，环境问题越来越受到人们的重视，污染环境的修复方法也成为全球关注的热点。在各种各样的环境污染治理技术中