一种防风转基因毛状根培养方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115820717A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211300524.3(22)申请日2022.10.24(71)申请人吉林农业大学地址130118吉林省长春市新城大街2888号(72)发明人韩忠明西芸霏王立岩王云贺王研孙卓杨利民(74)专利代理机构成都春夏知识产权代理事务所(特殊普通合伙)51317专利代理师陈春华(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H4/00(2006.01)A01H5/06(2018.01)A01H6/06(2018.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种防风转基因毛状根培养方法(57)摘要本发明公开了一种防风转基因毛状根培养方法，属于生物技术领域。本发明的培养方法包括：S1.将防风种子消毒后培养，长成防风无菌苗；S2.将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；S3.将转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，OD值为0.6‑1.0，转基因侵染液制备完成；S4.外植体叶片上剪出伤口后放置于转基因侵染液当中侵染，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，取出，冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中，待毛状根长到2～3cm转入1/2液体培养基中培养。本发明首次通过含有pCAMBIA2301质粒的K599农杆菌诱导防风毛状根，建立了防风的转基因毛状根体系。CN115820717ACN115820717A权利要求书1/2页1.一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备外植体：将防风种子消毒后，接种于培养基中，培养长成防风无菌苗，得到外植体；S2.制备发根农杆菌：将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；S3.制备转基因侵染液：将S2的转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，当OD值为0.6‑1.0时，转基因侵染液制备完成；S4.防风毛状根的诱导在外植体的叶片上剪出伤口并放置于制备好的转基因侵染液当中,侵染后，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，而后将外植体用无菌水冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中除去杂菌，外植体伤口处陆续长出白色毛状根，待毛状根长到2～3cm，从叶片伤口处切下放入液体培养基中，摇床、遮光继代培养。2.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S1中的培养基为MS固体培养基；优选地，消毒后的防风种子于培养基中培养20～40天，长成防风无菌苗。3.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S2中，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒通过冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞；优选地，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞后，在含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB固体培养基上进行阳性筛选，挑取单克隆并提取质粒DNA，引物为：F‑2301AGAACCGACGACTCGTCCGT、R‑2301TCACACGTGGTGGTGGTGGT，通过PCR鉴定获得转基因发根农杆菌K599；优选地，PCR反应程序为：95℃预变性5min，按95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min的程序进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min。4.根据权利要求3所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S3中，将转基因发根农杆菌K599接种到含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB液体培养基中，在摇床28±2℃条件下培养2‑3d，得到活化好的转基因发根农杆菌K599；优选地，将活化好的转基因发根农杆菌K599刮取下来并用1/2MS培养基重悬，使其OD值为0.6‑1.0，转基因侵染液制备完成。5.根据权利要求4所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，所述YEB固体培养基中，卡那霉素含量为40～60mg/L，链霉素含量为40～60mg/L；优选地，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L；所述YEB液体培养基中，卡那霉素含量为40～60mg/L，链霉素含量为40～60mg/L；优选地，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L。6.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S4中，外植体在转基因侵染液当中的侵染时间为5～20min，优选为10min；或/和所述含有Cef的固体MS培养基中，Cef的含量为40～60mg/L，优选为50mg/L。7.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S4中，液体培养基包括1/2MS液体