用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107182786A(43)申请公布日2017.09.22(21)申请号201710479014.X(22)申请日2017.06.09(71)申请人吉林省农业科学院地址130033吉林省长春市生态大街1363号(72)发明人杨向东杨静赵倩倩邢国杰牛陆郭东全贺红利钱雪燕姚瑶(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)C12N5/04(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法(57)摘要本发明属植物生物技术领域，涉及一种用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法。利用该培养方法继代保存的大豆体细胞胚状体可以持续增殖3年以上仍具有极强的再生能力。本发明提供的大豆体细胞胚状体持续增殖培养基包含如下成分：1×改良MS盐，1×B5有机，天门冬酰胺670-750mg/L，2，4-D10-20mg/L，蔗糖10-30g/L，植物凝胶3-5g/L，PH5.7-6.2。培养条件为低光照强度(400-1000Lux)，光周期16/8小时(光/暗)，培养温度25±1℃，每2-3周继代一次。继代保存3年以上的大豆体细胞胚状体可以正常萌发并再生为完整的植株。本发明内容有效解决了大豆组织培养中外植体诱导与再生频率易受季节和环境影响的问题，为大豆组织培养和转基因研究持续提供高分生能力且同步化的体细胞胚状体。CN107182786ACN107182786A权利要求书1/1页1.一种用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法，包括如下步骤：(1)取开花后15-20天的大豆未成熟子叶接种于诱导培养基，于黑暗条件下培养6-8周后，在外植体周围诱导产生成簇、黄绿色的球形体细胞胚状体；(2)将球形胚状体转接至增殖培养基中培养，培养条件为400-1000Lux低光照强度，光周期为16小时光/8小时暗交替，培养温度25±1℃，每2-3周换一次增殖培养基，连续继代培养3年以上。2.根据权利要求1所述的用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法，其特征在于：所述诱导培养基包括以下成分：1×MS盐、1×B5有机、2，4-D40mg/L、蔗糖60g/L、琼脂8g/L，pH5.7。3.根据权利要求1所述的用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法，其特征在于：所述增殖培养基包含以下成分：1×改良MS盐、1×B5有机，天门冬酰胺670-750mg/L、2，4-D10-20mg/L、蔗糖10-30g/L、植物凝胶3-5g/L，PH5.7-6.2。4.根据权利要求3所述的用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法，其特征在于：所述1×改良MS盐包含以下成分：硫酸铵(NH4)2SO4：463mg/L硝酸钾KNO3：2830mg/L磷酸二氢钾KH2PO4：170mg/L硫酸镁MgSO4·7H2O：370mg/L氯化钙CaCl2·2H2O：440mg/L乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA：37.24mg/L硫酸亚铁FeSO4·7H2O：27.84mg/L硫酸锰MnSO4·H2O：16.9mg/L硫酸锌ZnSO4·H2O：8.6mg/L硫酸铜CuSO4·7H2O：0.025mg/L碘化钾Kl：0.83mg/L氯化钴CoCl2·6H2O：0.025mg/L硼酸H3BO3：6.2mg/L钼酸钠Na2MoO4·2H2O：0.25mg/L。5.根据权利要求2或3所述的用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法，其特征在于：所述1×B5有机包含以下成分：肌醇myo-inositol：100mg/L烟酸nicotinicacid：1mg/L盐酸吡哆醇pyridoxine-HCl：1mg/L盐酸硫胺素thiamine-HCl：10mg/L。2CN107182786A说明书1/5页用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法技术领域[0001]本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种用于大豆体细胞胚状体持续增殖和继代保存的培养方法。背景技术[0002]大豆是世界上最重要的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源。转基因技术的广泛应用为大豆功能基因组学的研究及新品种培育提供了有效手段。作为推广时间最早、推广面积最大的转基因作物，仅2014年，全球转基因大豆种植面积就达9000万公顷，占大豆总种植面积的82％，占全球转基因作物总种植面积的49％。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。[0003]组织培养作为转基因大豆研究和育种基础和前提，外植体细胞能否再生及再生频率的高低在很大程度上决定了大豆转化效率，并在一定程度上影响转基因大豆育种效率。目前大豆遗传转化中外植体细胞再生方式主要有2