一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109852617A(43)申请公布日2019.06.07(21)申请号201910160051.3(22)申请日2019.03.04(71)申请人甘肃农业大学地址730000甘肃省兰州市安宁区营门村1号(72)发明人王广张克信张艳蕾刘长仲(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司11212代理人谈杰(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/10(2006.01)A01N57/16(2006.01)A01P7/04(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图4页(54)发明名称一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用(57)摘要本申请公开了一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3)选取RNAi的靶标区域，并利用Primer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、扩增含T7promoter序列的双链目的DNA，然后利用试剂盒合成双链RNA。CN109852617ACN109852617A权利要求书1/1页1.一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，所述的方法包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3)选取RNAi的靶标区域，并利用Primer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物：正义链5’-3’GGCGTGGTTTGACTGGGATA反义链5’-3’CAACCAAAACCTGTCTGCGG；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、对①中的特异性引物5’-端加上T7promoter序列：TRE-1：TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTGGTTTGACTGGGATATRE-2：TAATACGACTCACTATAGGGCAACCAAAACCTGTCTGCGG，用于扩增含T7promoter序列的双链目的DNA，然后利用试剂盒合成双链RNA。2.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤③中的试剂盒为TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit试剂盒。3.权利要求1或2任一项所述的方法制备得到的豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列在防治豌豆蚜中的应用。2CN109852617A说明书1/6页一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用技术领域[0001]本申请属于病虫防治领域，具体涉及一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用。背景技术[0002]豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)属同翅目(Homoptera)蚜科(Aphididae)，在世界各地广泛分布，是许多豆科作物及牧草的主要害虫之一。在我国西北苜蓿种植区，豌豆蚜每年可造成苜蓿生产10％～30％的经济损失。豌豆蚜危害植物时，以刺吸式口器吸取植物韧皮部汁液，从而影响植物的生长发育，开花结果等正常生命活动，危害严重时造成整株植物死亡。豌豆蚜可以作为植物病毒的传播者，可以传播苜蓿花叶病毒，豌豆耳突花叶病毒等25种病毒。由于豌豆蚜繁殖力强，发生代数多，生态适应性强等原因，对蚜虫的防治至关重要。由于化学杀虫剂的高频率和高浓度的等不合理使用，污染生态环境，危害人类和牲畜健康。为了探索新的防治方法对于减少农药污染，提高牧草产量与品质具有重要意义。[0003]海藻糖作为昆虫血糖，几乎存在于昆虫的所有组织和器官中。主要分布在脂肪体、肠道、血液、卵巢甚至在腿部肌肉也有合成。海藻糖不仅作为能源和碳源，而且作为蛋白质和细胞膜的稳定器、作为敏感化合物或生长调节器和昆虫细胞壁的结构组成的前体物，对昆虫的生存与死亡起着决定性的重要作用。海藻糖对昆虫的生长发育和蜕皮变态过程发挥着重要作用，如昆虫迁飞、取食行为、免疫抗性、越冬和滞育等。海藻糖可以通过浓度的高低调节味觉感受器和中枢神经系统从而影响昆虫对食物的选择和取食行为。海藻糖酶对豌豆蚜体内海藻糖分解和几丁质合成中都有重要作用。海藻糖突变体造成昆虫体内海藻糖累积，提高死亡率和影响取食行为。抑制海藻糖酶的活性，显著抑制昆虫的生长，造成蜕皮困难和大幅度增加死亡率。过量海藻糖、葡萄糖影响几丁质代谢，显著增加昆虫畸形和死亡率，高海藻糖比低海藻糖的对昆虫影响大。可见，海藻糖酶在维持昆虫体内海藻糖平衡和几丁质合成中有重要作用，海藻糖酶的活性对昆虫的生长发育十分重要。[0004]RNAi是Fireetal在1998年阐述双链RNA(d