同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110423779A(43)申请公布日2019.11.08(21)申请号201910625467.8A61K39/23(2006.01)(22)申请日2019.07.11A61P31/20(2006.01)(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人刘光清戚睿斌缪秋红朱杰李传峰陈宗艳(74)专利代理机构上海段和段律师事务所31334代理人李慧郭国中(51)Int.Cl.C12N15/866(2006.01)C12N7/01(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图4页(54)发明名称同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用(57)摘要本发明公开了一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用，所述病毒采用以下方法制备：A、分别扩增classicRHDV和RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因分别与pEASY-Vector连接，转化培养后得质粒；C、将步骤B得到的质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得。采用该杆状病毒制备的预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。CN110423779ACN110423779A权利要求书1/1页1.一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、分别扩增classicRHDV和RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的classicRHDV和RHDV2的VP60基因分别与pEASY-Vector连接，转化培养后得质粒pEASY-classicRHDV-VP60、pEASY-RHDV2-VP60；C、将步骤B得到的两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，然后转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。2.根据权利要求1所述的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤A中，分别扩增classicRHDV及RHDV2的VP60基因采用的引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的引物对、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的引物对所示。3.根据权利要求1所述的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤C中，将两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体的具体步骤为：先将pEASY-classicRHDV-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段1与质粒连接，获得pFastBacDual-classicRHDVVP60；然后将pEASY-RHDV2-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段2与pFastBacDual-classicRHDVVP60连接。4.一种根据权利要求1所述方法制备的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。5.一种根据权利要求1所述方法制备的重组穿梭质粒。6.一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的应用，其特征在于，所述应用包括：采用所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒制备预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗。7.一种预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒感染昆虫细胞后收集，破碎后离心，所得上清液中加入终浓度0.1％的甲醛，孵育以灭活重组杆状病毒；S2、将步骤S1处理后的上清液等体积加入佐剂中乳化，即得所述疫苗。2CN110423779A说明书1/7页同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用。背景技术[0002]兔病毒性出血症俗称兔瘟，是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、热性、败血型和毁灭性的传染病。该病于1984年在我国江苏省无锡地区首次爆发，随后在意大利出现并由此传遍整个欧洲并波及全球，对养兔业造成了巨大的经济损失。2010年研究人员在法国发现了一例非典型兔