一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111387058A(43)申请公布日2020.07.10(21)申请号202010396058.8(22)申请日2020.05.12(71)申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人王海平刘卓雅李锡香宋江萍赵青张晓辉(74)专利代理机构北京卓岚智财知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11624代理人郭智(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)A01N3/00(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图2页(54)发明名称一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备(57)摘要本发明属于农产品超低温保存技术领域，公开了一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法及超低温保存设备，取长势好的愈伤组织接进行预培养；用低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；低温保护剂处理后茎尖的复温；低温保护剂处理后茎尖的恢复；将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。通过本发明方法，有效提高大蒜组织超低温保存效果，提高了大蒜愈伤组织超低温保存后的成活率：预培养时间2天，加载介质装载时间20分钟，PVS2玻璃化溶液处理15分钟，会使愈伤组织成活率明显提高。本发明的方法可应用于大蒜愈伤组织超低温保存,其操作过程简易，易应用于生产，可用于大蒜种质资源的高效安全保存。CN111387058ACN111387058A权利要求书1/2页1.一种大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述大蒜愈伤组织超低温保存的方法包括：步骤一、取长势好的愈伤组织接进行预培养；步骤二、对低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化；步骤三、低温保护剂处理后茎尖的复温；步骤四、低温保护剂处理后茎尖的恢复；步骤五、将恢复后的愈伤组织接入培养基进行初代培养及扩繁。2.如权利要求1所述的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述步骤一取长势较好的愈伤组织接入在含有GamborgB5基础培养基+NAA+2iP的培养皿上，接种好的培养皿放在黑暗中，进行预培养，具体包括：步骤1、配置含pi和NAA的GamborgB5培养皿：向蒸馏水中添加GamborgB5basalmedium3.21g/L、2iP0.05毫克/L、NAA0.01毫克/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5克/L；步骤2、接种：将愈伤组织接种在培养皿放在黑暗中5℃的条件下，分别进行预培养2天。3.如权利要求2所述的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述2iP保存在零下20度冻存，并分装。4.如权利要求1所述的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述步骤二以PVS2作为低温保护剂进行装载、脱水、玻璃化，具体包括：步骤S21、装载：将预培养的愈伤组织转移到加载介质的培养皿中，愈伤组织浸泡二十分钟；步骤S22、脱水：二十分钟后用取出愈伤组织，用0℃冷冻过的PVS2玻璃化溶液替代，将茎尖置于PVS2溶液中，置于冰上十五分钟；步骤S23、玻璃化：十五分钟后，将4～5个茎尖放在无菌的箔条上；将箔条插入含有液氮的浅容器中。5.如权利要求4所述的大蒜愈伤组织超低温保存方法，其特征在于，所述加载介质的培养皿为MSbasalsaltmixture52.165g/L、甘油184.2g/L、蔗糖205.4g/L、MS-G625ml和MS-vitamins610ml。6.如权利要求5所述的大蒜愈伤组织超低温保存方法，其特征在于，所述MS-G6溶液由硫胺素0.08g/L、肌醇20g/L配制，冷冻保存。MS-vitamins6溶液由甘氨酸0.2g/L、肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L和硫胺素0.01g/L配制，在5℃下储存。7.如权利要求4所述的大蒜愈伤组织超低温保存方法，其特征在于，所述PVS2玻璃化溶液由甘油300g/L、乙二醇135ml、试剂级蔗糖137g/L和DMSO136ml配制，在超净工作台进行过滤。8.如权利要求1所述的大蒜愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：将箔条浸入1.2M蔗糖+1/2MS培养基中浸泡二十分钟，十分钟后换新的溶液，加热到愈伤组织脱落，从介质中移除箔条；二十分钟后，将组织转移到含有GamborgB5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，将培养皿用铝箔包裹，放置在生长室24小时；所述1.2M蔗糖+1/2MS培养基为MSbasalmediumw/vitamins5(M5192)4.43g/L、蔗糖2CN111387058A权利要求书2/2页410.76g/L。9.如权利要求1所述的大蒜愈伤组织超低温保存方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：24小时后，将组织移入含有GamborgB5基本培养基+NAA+2iP的新培养皿中，用锡纸包裹，将