百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102823582A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102823582A(43)申请公布日2012.12.19(21)申请号201210349629.8(22)申请日2012.09.18(71)申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人申晓辉李晓丹任丽张荻(74)专利代理机构上海光华专利事务所31219代理人许亦琳余明伟(51)Int.Cl.A01N3/00(2006.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书55页页附图附图11页(54)发明名称百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法(57)摘要本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。本发明通过对玻璃化超低温保存过程中处理方法、条件、试剂的特殊设计实现了百子莲胚性愈伤组织的超低温保存，为百子莲种质资源的保存提供了技术保证，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径，将对热带或含水量较高的植物资源的保存以及无性扩繁技术体系的完善起到指导作用。CN102835ACN102823582A权利要求书1/1页1.一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。2.如权利要求1所述的超低温保存方法，其特征在于，具体步骤如下：1）低温-高渗预处理：将百子莲胚性愈伤组织置于预处理培养基中，4℃培养；2）脱水处理：将步骤1）预处理后的百子莲胚性愈伤组织置于装载液内脱水处理后，吸除表面的装载液，再置于玻璃化溶液中，于0℃进一步脱水处理；3）液氮保存：除去步骤2）进一步脱水处理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速转入液氮中进行保存。3.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述百子莲胚性愈伤组织为继代培养20d，易碎、松散的百子莲胚性愈伤组织。4.如权利要求3所述的超低温保存方法，其特征在于，所述继代培养的培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。5.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述预处理培养基是蔗糖含量为0.3～0.7M的MS固体培养基；预处理的培养时间为1～5d。6.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，所述装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mMKNO3的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。7.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，装载液脱水处理的时间为20～80min，玻璃化溶液脱水处理的时间为20～80min。8.一种针对权利要求1-7任一权利要求所述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法的解冻及再培养方法，为将玻璃化超低温保存的百子莲胚性愈伤组织从液氮中取出，置于35～40℃水浴中快速解冻，然后用洗涤液洗涤，再吸干表面的洗涤液，最后转入恢复培养基中进行恢复培养。9.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1.2M蔗糖和10mMKNO3的MS培养液。10.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基，所述恢复培养的条件为黑暗环境，恢复培养的温度为23～27℃。2CN102823582A说明书1/5页百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法技术领域[0001]本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法。背景技术[0002]百子莲（Agapanthuspraecoxssp.orientalis）又称‘蓝百合’，为多年生根茎类花卉，原产非洲南部地区。百子莲叶形秀丽，花朵姿态优美，花色淡雅，花期持续时间长，具备抗逆性强，观赏性强的特点，从其叶片及根茎的药用成分利用到花的观赏，从庭院栽培到切花生产，拥有较高的观赏价值及应用价值，是西方发达国家高档鲜切花、盆花和沿海公园地被材料，也是除玫瑰花之外最能表达爱意的爱情花。为了快速繁殖引进的优良种质资源，需要开展百子莲优良种质资源无性扩繁技术研究。但发现百子莲胚性愈伤组织增殖速率在继代3周左右达到最大，以后开始逐渐下降。为维持较高的细胞增殖速率，必须每隔2～3周继代一次，但长时间连续继代在高浓度激素增殖培养基上会引起细胞胚性丧失或胚胎败育等问题