农杆菌介导的红椿遗传转化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113215191A(43)申请公布日2021.08.06(21)申请号202110452887.8(22)申请日2021.04.26(71)申请人华南农业大学地址510665广东省广州市天河区五山(72)发明人毛文迈宋慧云李悦李培王悦阳林慧娟姚驰陈晓阳(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司44224代理人王秉丽(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N1/20(2006.01)A01H5/00(2018.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书2页说明书16页序列表1页附图5页(54)发明名称农杆菌介导的红椿遗传转化方法(57)摘要本发明涉及一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养、根的诱导培养；所述菌液中含有乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有乙酰丁香酮。采用本发明的方法，成功实现农杆菌介导的红椿遗传转化，并且遗传转化率保持在10％左右，采用本发明的方法重复性及稳定性好，适用于批量化育苗，有利于农业产业化发展。CN113215191ACN113215191A权利要求书1/2页1.一种农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以红椿的叶片为外植体，用携带有植物表达载体的根癌农杆菌的菌液侵染所述外植体；将经过侵染的所述外植体接种于共培养培养基，共培养；对经过共培养的所述外植体进行诱导培养，诱导培养包括：愈伤组织的诱导培养、不定芽的诱导培养、芽的诱导培养以及根的诱导培养；所述菌液中含有乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有乙酰丁香酮。2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述菌液中含有45mmol/L～155mmol/L的乙酰丁香酮，所述共培养培养基中含有145mmol/L～155mmol/L的乙酰丁香酮。3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L6‑BA、0.8mg/L～1.2mg/LKT、0.03mg/L～0.06mg/LNAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂和145mmol/L～155mmol/L乙酰丁香酮的MS培养基。4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，共培养的条件包括：避光，温度为23℃～27℃，时长为22h～26h；或/和，侵染之前，对所述外植体进行超声波处理，超声波处理的时长为25s～35s，超声波处理的功率为4.5kHz～5.5kHz。5.根据权利要求1至4任一项所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1305.2，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。6.根据权利要求5所述的农杆菌介导的红椿遗传转化方法，其特征在于，所述愈伤组织的诱导培养采用T1培养基，所述T1培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L6‑BA、0.8mg/L～1.2mg/LKT、0.03mg/L～0.06mg/LNAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂和90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠的MS培养基；所述不定芽的诱导培养采用T2培养基，所述T2培养基为含2.8mg/L～3.2mg/L6‑BA、0.8mg/L～1.2mg/LKT、0.03mg/L～0.06mg/LNAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基；所述芽的诱导培养采用T3培养基，所述T3培养基为含0.25mg/L～0.35mg/L6‑BA、0.18mg/L～0.22mg/LNAA、28g/L～32g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基；所述根的诱导培养采用T4培养基，所述T4培养基为含0.08mg/L～0.12mg/LNAA、13g/L～17g/L蔗糖、4.8g/L～5.2g/L琼脂、90mg/L～110mg/L头孢噻肟钠和9mg/L～11mg/L卡那霉素的MS培养基；或/和诱导培养的条件包括：温度为23℃～27℃，光照强度为2300lx～2700lx，每天光照时长为10h～14h，培养基更换频率为每13d～16d更换一次。7.根据权利要求1至4以及6任一项所述的农杆菌介导的红椿遗传转