农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN103215307103215307B(45)授权公告日2014.07.09(21)申请号201210016150.2宁国贵等.梅花不同外植体离体培养及体细胞胚诱导植株再生.《园艺学报》.2010,第37(22)申请日2012.01.18卷(第1期),114-120.(73)专利权人华中农业大学曹亮.梅花再生体系建立的研究.《中国地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街优秀博硕士学位论文全文数据库（硕）农业科技1号辑》.2007,(第1期),全文.(72)发明人张俊卫杨洁闻娟张蔚审查员徐强一包满珠(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人张红兵(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)A01H4/00(2006.01)A01H5/00(2006.01)(56)对比文件闻娟.梅花再生体系建立及遗传转化初步研究.《中国优秀硕士学位论文科技辑农业科技辑》.2012,(第S1期),全文.权利要求书2页权利要求书2页说明书10页说明书10页序列表4页序列表4页附图5页附图5页(54)发明名称农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法(57)摘要本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法。本发明的步骤包括遗传转化、筛选再生、GUS染色检测和PCR检测。其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因和PmCBFb基因导入受体梅花成熟子叶细胞中，对影响梅花成熟子叶转化的不同因素进行了筛选，利用卡那霉素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，再通过GUS染色或PCR检测等辅助方法筛选得到转基因梅花植株。本发明的优点在于，本发明的遗传转化体系不经过体细胞胚发生途径，直接获得转基因植株，因而显著提高了梅花的遗传转化效率。CN103215307BCN103257BCN103215307B权利要求书1/2页1.一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示：1）预培养：将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养0-5d；2）菌株的制备：从-70℃冰箱中取出保存的包含有GUS报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为OD600=0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心10min，去上清液，将收集得到的农杆菌置于100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28℃恒温摇床上200r/min重悬培养2-4h后用于转化受体的侵染；3）侵染：将步骤1）的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2）中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2-3分钟摇动一下；4）共培养：将步骤3）中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养1-5d；5）选择培养：将步骤4）中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2℃光下培养，光照强度为20001x，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；6）成苗培养：将步骤5）中再生出的不定芽接种到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001x，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；7）生根培养：将步骤6）获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株；8）将步骤7）中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或提取步骤7）中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株；其中PmCBFb基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示；上述培养基组分及配制：成熟子叶再生培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，蔗糖30.0g/L，